Cours 9: L’identification des gènes et des protéines d’intérêts; Le clonage moléculaire et la technologie de l’ADN recombinant

Question 1

Quel est le dogme central de la biomol? (+ 4 détails)

Answer 1

ADN dans noya transcrit en ARNm et sort du noyau pour être trad en prot, en réalité c’est bcp + complexe

o ADN:
• Source de l’information génétique
• Localisé dans le noyau
• Structure double hélice (A se pair avec T et C avec G)

en 90s, on estimait que humains avaient 100 000 gènes dans génome humain, aujd on estime env 20 000 gènes dans le génome humain, on a bcp réduit l’estimation qu’on avait, le nbre de gènes dans le génome n’a pas de lien avec la complexité de l’org, raisins ont 30 000, ça s’explique au niveau de l’ARNm

o Transcription:
• Chaque séquence de 3 nucléotides code pour un acide aminé
1. Ribose au lieu de 2 deoxyribose
2. Simple brin
3. Thymine est remplacé par uracile
• Suite a la transcription, l’ARN est épissé
• Humain: 100 000 transcrits

o Traduction:
• Il y a un code précis pour la conversion des nucléotides en acide aminé
• Chaque codon code pour un acide aminé spécifique
• Humain: > 1 000 000 protéines

Question 2

Qu’est-ce que le criblage génétique? (2 types)

Answer 2

• Criblage classique (en avant)
• Identifier les gènes importants pour un phénotype biologique
• Milliers de gènes a la fois
• Générer des hypothèses
• Criblage inversé
• Sélectionner un gène et déterminer les phénotypes associés
• 1 gène a la fois
• Evaluer une hypothèse

Question 3

Comment se fait le criblage classique chez les modèles animaux? (6 étapes)

Answer 3

Identifier des gènes causant un phénotype anormal
1. É laborer un test afin de mesurer le phénotype
• Simple
• Quantitatif
• Permettant de distinguer les animaux normaux de ceux qui ont un phénotype anormal
• Souvent utilisé dans des organismes modèles (vers, mouches)
2. Mutagenèse des oeufs/larves
• Mutagenèse chimique (EMS, ENU)
• Mutagenèse par irradiation (UV haute intensité)
• Mutagenèse par insertion: (transposon)
3. Dépistage d’un phénotype anormal
• Après la production de 100 1000 lignées, chacune est évaluée
par un test phénotypique (étape 1)
• Les lignées avec phénotype sont maintenue
4. Test de complémentation
• Déterminer si les mutations identifiées sont uniques ou non
par des croisements
• Méthode utilisée lorsque plusieurs mutant présente le même
phénotype
5. Localiser le gène
o Analyse de liaison (chimique et irradiation)
o Séquence du transposon (insertion)
6. Cloner le gène
• Identifier la séquence de l’ADN

Question 4

Quels sont les 3 modes de mutagenèses?

Answer 4

• Chimique: provoque des mutations ponctuelles (un seul nucléotide)
o Les mutations peuvent être non sens, faux sens ou dans la séquence non codante (influencer l’ épissage et les éléments régulateurs)
o Avantage : Permet de nombreuses mutations différentes au sein des régions géniques
o Désavantage : Difficile a cartographier

• Irradiation: provoque des ruptures dans l’ADN double brin
o Génère des grandes délétions ou réarrangements chromosomiques
o Avantage: Facile a cartographier par analyse cytogénétique
o Désavantage : Souvent pas limite a un gène unique. Pas approprié pour une analyse fine.

• Insertion: contient un gène marqueur
o Peut insérer dans la région codante perturbe la séquence d’acides aminés
o Peut insérer dans les régions non codante adjacente perturbe l’ épissage ou l’expression du gène
o Avantage: Facile a cartographier du au « transposon tag », stable
o Désavantage : Transposition secondaire possible. Ne s’applique a toute les espèces.

Question 5

Qu’est-ce que le criblage génétique inverse?

Answer 5

• Identifier un gène d’intérêt
• Perturber ce gène pour déterminer son rôle suivant la variation des phénotypes
o Knockouts
o Edition du génome

Question 6

Comment se fait l’édition du génome par nucléase?

Answer 6

Besoin d’unt prot fokl qui lie brin ADN et coupe (ou ya sites de liaison reconnues par prot) et ya réparation (NHR -> délétion ou donne s ADN spécifique pour induire mutation spécifique)
Peut faire autant KO que knock in avec cette méthode
• Forme d’immunité acquise dans les bactéries
• Favoriser HDR ( S et G2 cycle cellulaire
o Cellules moins confluentes
o Utilisation de facteurs activateurs (ex: Rad18, hRad51) ou inhibiteurs (ex: CYREN)
ARN guide spécifique à notre gène d’intérêt
PAM peut varier selon la nucléase utilisée.

Question 7

Comment se fait le criblage génétique chez l’humain? (6 méthodes)

Answer 7

Identifier un locus d’intérêt associé
avec un phénotype

• Marqueurs microsatellites
o Avantage: Très polymorphique
o Désavantages: Couverture inégale, parfois des gap

• Micropuce SNPs
o Avantage: Grande quantité de marqueurs
o Désavantage: Peu polymorphique

• Analyse de liaison
o Nécessite des grandes familles
o Pour les maladies Mendéliennes
o Calcul de score LOD (significatif établi a 3)

• Études d’association (GWAS)
o Nécessite beaucoup d’individu
o Pour les maladies ou traits complexes

• Séquençage de l’ exome
o Permet d’identifier les variants
o Avantages: Identifie directement les variants potentiels, nécessite pas de grande familles
o Désavantages: Couvre 2% du génome, plus dispendieux

• Séquençage du génome
o Permet d’identifier les variants et CNVs
o Avantages: Identifie directement les variants potentiels, nécessite pas de grande familles, couvre le génome en entier (ou presque …)
o Désavantages: Dispendieux, limitation dans l’interprétation des données

Le criblage classique chez l’humain va souvent être suivit d’un criblage inversé dans un modèle animal afin de valider l’association génotype phénotype

Question 8

Comment se fait le criblage in silico? (3 méthodes)

Answer 8

• Pourquoi effectuer un criblage in silico : Identifier par une approche bio informatique des gènes ou protéines d’intérêts

• BLAST (NCBI)
o Compare les séquences d’ADN et protéines
o Librairie de séquences provenant de toute les espèces
o Comparaison basée sur la similarité de séquence

• Ensembl
o Emphase sur les analyses génomique
o Génomes complets des organismes modèles ainsi que d’autres espèces
o Alignement de séquence et homologie entre les gènes
o Extraction de séquences d’intérêts

• UCSC
o Similaire à Ensembl
o Possède une fonction BLAT (même chose que BLAST)
o Beaucoup d’information additionnelle (maladies, marqueurs génétiques, etc.)

Question 9

Comment se fait le criblage moléculaire? (2 méthodes)

Answer 9

• Pourquoi faire un criblage moléculaire: Identifier des gènes en lien avec un processus biologique spécifique

• Micro puce cDNA
o Avantage: Analyse simple, peu coûteux
o Désavantage : Sondes prédéterminées

• Séquençage de l’ARN
o Avantage: Séquençage de tous les transcrits exprimés dans le tissu, possibilité de détecter les transcrits de faible abondance
o Désavantage : Plus coûteux, nécessite expertise

Question 10

Qu’est-ce que la PCR? (3 méthodes)

Answer 10

• PCR: Permet d’amplifier les fragments

• PCR standard
o ADN -> ADN

• PCR transcription inverse (RT PCR)
o ARNm -> ADNc

• RT PCR quantitatif ( qRT PCR)
o Analyse quantitative de l’ARNm
o Détection du signal fluorescent qui est créé proportionnellement aux produits amplifiés par le PCR

Question 11

Qu’est-ce que le clonage?

Answer 11

• Processus qui vise à faire plusieurs copies de l’ADN d’intérêt
• Les bactéries sont souvent utilisées comme hôte
• Système d’entreposage: Le vecteur
o Caractéristique: Une origine de réplication, peut être combiné à
d’autres morceaux d’ADN, marqueur de sélection.
• Type de vecteurs
o Plasmide, phage, cosmide, chromosome artificiel
o Vecteur de clonage : ADN répliqué mais pas exprimé
o Vecteur d’expression : ADN est répliqué et peut être exprimé grâce à un promoteur approprié
• Ligation & transformation

Question 12

Comment on peut purifier l’ADN? (2 méthodes)

Answer 12

• Électrophorèse sur gel d’agarose
o Cathode ( (--) --> anode
L’ADN est chargé négativement

• Purification chimique d’ADN à partir de bactéries
• Kits
o Mini prep 
o Midi prep
o Maxi Prep

Question 13

Comment se fait la visualisation de l’ADN sur un gel?

Answer 13

• Bromure d’ ethidium
• Fluorescence ( redSafe
• Agents intercalant qui fluoresce lorsqu’exposé aux UV
• L’intensité de la bande d’ADN est basé sur le nombre et la taille des fragments

Question 14

Comment se fait l’identification de l’ADN?

Answer 14

• Séquençace de type Sanger
séquençage par synthèse
fragment d’intérêt, fait PCR, utilise oligont (même que PCR0 mais nécessite 1 seul, met en présence de nt, chque nt couplée à molé fluo de couleur diff et on fait synthèse, à cchque fois que nt fluo est intégrée, r s’arrête donc on obtient toutes les possibilités possibles pour longueur du fragment, fait migrer r de séquençage dans capillaire gel en fction du poids et laser qui lit molé fluo et reconstruit séquence et avec la séquence on peut vérifier si l’insert à été bien intro et si ya pas eut de mutations intro par la bact

Question 15

Quelles sont les 7 étapes du clonage?

Answer 15

1) Isolation du matériel génétique
2) Amplification par PCR
3) Couper vecteur avec enzyme de
restriction
4) Ligation
5) Transformation
6) Purification/isolation
7) Séquençage

Question 16

Qu’est-ce que la Transduction du signal et signalisation

intracellulaire?

Answer 16

• Voie extracellulaire
o Récepteurs membranaires
• Voie intracellulaire
o Changements métaboliques ou
structuraux

Question 17

Qu’est-ce qu’un Ac, un épitope et les 2 manières de les produire?

Answer 17

• Anticorps : Protéines utilisées par le système immunitaire pour détecter un antigène
• Épitope : Région de l’antigène reconnue par l’anticorps

Monoclonaux: injeecte Ag dans rongeur, isole cell immun dans rate (cell B) et utilise cultures myélomes et fait coculture (hybridome) des 2 types de cell, ensuite dans coculture sélectionne cell exprimant Ac et purifie Ac et crée Ac monoclonal pcq toutes les cell isolées reconnaissent le même épitope

Polyclonal: utilise lapins, injecte Ag, laisse syst immun du lapin prod ses propres Ac, collecte sang, centrifugation pour isoler cell et isole Ac, Ac sont polyclonaux pcq reconnaissent +ieurs épitopes pcq lapin les a prod

Question 18

Comment se fait la purification des prot?

Answer 18

• Avec des protéines purifiées, on peut:
o Produire des anticorps
o Déterminer la séquence protéique
o Identifier les interactions entre protéines
• Deux méthodes:
o Chromatographie
o Immunoprécipitation

Question 19

Qu’est-ce que la chromatographie?

Answer 19

• Une façon de séparer un mélange de protéines sur une colonne
• Interaction des protéines avec la
matrice
o Séparation par charge, taille, hydrophobicité
o Affinité d’une protéine
o La séparation est dépendante du type de matrice, du tampon et des propriété intrinsèques de la protéine

Question 20

Comment se fait l’IP?

Answer 20

• Utilisation des anticorps pour la purification d’une protéine d’intérêt
utilise Ac au lieu de colonne
Est + précis que colonne
on a mélange de prot et Ac vient reconnaître prot d’intérêt et on fait lavage poru garder seulement prot d’intérêt
Ac sont couplés à une bille pour, en changeant pH ou conc en sel de sltion, on peut libérer la prot de l’Ac et on se retrouve avec la prot relativement pure en sltion

Question 21

Quelles sont les 5 méthodes pour mesurer l’expression des prot?

Answer 21

• Western blot
• •“ELISA (Enzyme linked immunoabsorbant assay)”
• Radioimmunoassay
• Immunohistochimie
• Immunomicroscopie électronique

Question 22

Qu’est-ce que le WB?

Answer 22

• Méthode la plus utilisée pour mesurer l’expression d’une protéine
• Extraire les protéines d’un échantillon (ex. Morceau de cerveau, muscle)
• Dans le gel de polyacrylamide
o Protéines de grande taille migrent lentement
o Protéines de petite taille migrent
rapidement
• Habituellement Gel dénaturant (SDS PAGE)
o Migration en fonction du poids
• Gel natif
o Migration en fonction du poids et de la charge

Question 23

Comment se fait la Visualisation immunobuvardage?

Answer 23

• Anticorps primaire

* Anticorps secondaire conjugué avec un isotope radioactif, un enzyme (HRP), ou un fluorophore

Question 24

Comment se fait le Fractionnement cellulaire (méthode d’enrichissement)?

Answer 24

• Les organelles individuelles dans une cellule, qui variant selon leur poids, peuvent être séparées dans la solution par une série d’étapes de
centrifugation

Question 25

Qu’est-ce que le Dosage
immuno enzymatique
ELISA)? (diff avec WB)

Answer 25

• Alternative au WB
• Différences avec WB:
1. Peut quantifier des nanogrammes de protéines
o WB microgrammes
2. Pas de dénaturation
3. Ne permet pas de distinguer les isoformes
4. Quantification plus précise

Question 26

Qu’est-ce que Essai radioimmunologique (RIA)?

Answer 26

• Concept: déterminer le ratio de protéines liées:non liées afin d’identifier la concentration d’un échantillon
• Très sensible pour mesurer les concentrations très basses de protéines
• Les échantillons proviennent habituellement du sang, liquide extracellulaire, ou liquide céphalorachidien
• Ex: neuropeptides dans le liquide extracellulaire de cerveau

Question 27

Qu’est-ce que l’Immunohistochimie (IHC) & immunomicroscopie électronique?

Answer 27

• IHC:
o Méthode pour visualiser l’expression des protéines
o Procure un visualisation dans l’espace
o Pas très quantitatif
• IME:
o Extension de IHC en combinaison avec microscopie électronique
o Procure un visualisation dans l’espace au niveau des structures sous cellulaires

Question 28

Comment on détecte les interactions prot-prot?

Answer 28

• Co immunoprecipitation
o Extension d’IP
o Si les partenaires sont connues:
Séparer et identifier par SDS
PAGE/WB
o Si les partenaires sont inconnues:
Déterminer par spectrométrie de
masse

Question 29

Qu’est-ce que la Spectrométrie de masse?

Answer 29

• Détermination effectué par le ratio masse à charge des protéines, peptides et leurs fragments
• Les logiciels comparent la masse calculée des fragments de protéines et peptides à une base e données

Question 30

Comment on détecte les Interaction protéine ADN?

Answer 30

• Étudier l’impact des protéines sur la transcription
• 3 méthodologies principales
o Test de mobilité électrophorétique (EMSA)
o IP de chromatine ( ChIP
o Essaie de luciférase

Question 31

Qu’est-ce que le Test de mobilité électrophorétique?

Answer 31

• Utiliser pour déterminer si une protéine est capable d’interagir directement avec une courte séquence spécifique d’ADN
o Contrôles: essai compétitif
o Avantage: Détecte les événements de faible quantité, peut tester plusieurs sondes avec le même lysat
o Désavantage in vitro, pas quantitatif

Question 32

Qu’est-ce que l’IP chromatine (ChIP)?

Answer 32

• Utilisé pour déterminer si une protéine interagit avec une région d’ADN spécifique
o Avantage: Matériel de départ = cellules vivantes
o Désavantage Impossible de déterminer si une protéine interagit avec une séquence d’ADN directement ou si elle fait partie d’un complexe
• Contrôles: « input », liaison ADN protéine connue, anticorps non spécifique ( Ig ) et amorces non spécifiques

Question 33

Qu’est-ce que le ChIP

seq?

Answer 33

• Maintenant très utilisé
o Avantage: pas limité par des sondes prédéterminées
o Désavantage : Dispendieux, nécessite plus de tissue et une expertise pour l’analyse
• Même approche, mais l’ADN libéré est séquencé (séquençage à haut débit)
• L’analyse bio informatique permet de distinguer les interactions.

Question 34

Qu’est-ce que l’Essai luciférase?

Answer 34

• Concept: Déterminer si une protéine peut activer ou réprimer l’expression d’un gène cible
Pas juste voir si ya interaction, check si ya variation expression
• Bioluminescence (luciférase: enzyme de luciole)
o Avantage: Connection fonctionnelle, quantitatif
o Désavantage : Ne peut pas détecter si interaction directe

Question 35

Qu’est-ce qu’une Modification post

traductionnelles?

Answer 35

• PTMs : modification biochimique qui se produit sur un ou plusieurs acides aminés
• Les PTMs changent souvent les propriétés ultrastructurelles et fonctionnelles d’une protéine
Ex: activité. Localisation, interaction avec d’autres protéines
• Chaque PTM à son propre essai biochimique

Question 36

Comment se fait la Détection des PTMs par anticorps?

Answer 36

• Possibilité de produire un anticorps qui se lient à sa protéine substrat seulement en présence des PTMs
• Pourrait reconnaitre le PTM directement ou en lien avec un changement ultrastructurel causé par ce PTM