Cours 12: Visualisation de la fonction neuronale

Question 1

L’histologie fixée permet quoi?

Answer 1

C’est bon pour apprendre composantes d’une cell mais on peut pas voir composantes dynamiques ou les rép des neurones

Question 2

Qu’est-ce qu’un marqueur statique de l’activité, ses 2 approches et sa limite?

Answer 2

• Certaines fonctions cellulaires peuvent être examinées à l’aide de marqueurs d’activité dans des coupes histologiques de cerveau fixées (p.ex. après l’activité neuronal).
Donnent indice de activité neuronale mais statique, c’est l’indice à un moment précis, on peut pas voir comment ça change dans le temps, techniques limitées à coupes histo, peut regarder les résultats après l’activité neuronale, rép est accumulation de prot
Deux approches:
1. Observer indirectement la présence d’activité en mesurant des produits qui s’accumulent durant ou après le processus.
2. Incorporer un marqueur dans les cellules. Ce dernier indique la présence d’activité dans des futures examens histologiques.
Limitation: On observe l’activité à un moment bien défini (snapshot) d’un processus dynamique

Question 3

Comment évaluer l’activité neuronale dans les tissus fixés?

Answer 3

• L’activité neuronale induit rapidement (quelques minutes) la transcription transitoire d’un groupe de gènes connus comme les gènes précoces immédiats (immediate early genes: IEGs).
• Ces gènes encodent un éventail divers de protéines jouant un rôle dans la plasticité neuronale, incluant: facteurs de transcription (c-fos, c-mycet c-jun), protéines interagissant avec le cytosquelette (Arc), facteurs de croissance (BDNF).
• Les gènes précoces immédiates (IEGs) ne donnent qu’un premier indice sur la fonction d’une région du cerveau

Question 4

Quelles sont 2 méthodes histo pour détecter les IEG?

Answer 4

ISH: Façon très sensible pour détecter les IEG
Se base sur le principe de génération d’une sonde ARN, complémentaire à l’ARN d’intérêt
Hybride (incubation) de sonde avec une section du tissu et fait r colorimétrique pour voir ou la sonde est localisée dans le tissu
Allen brain atlas: Montre images de hybridation dans un cerveau pour voir distribution des sub d’intérêt et même à diff étapes du dév

IHC

Question 5

Comment l’immunoréactivé de c-Fos est un marqueur de l’activité dans le cortex visuel? Quels sont les 3 limitations?

Answer 5

Si on stim un oeil et ferme l’autre, la + grande partie des fibres vont contro mais un peu vont ipsi pour vision binoculaire
Utilise marqueur pour un des 1ers gènes qui s’accumule après activité neuronale
Neurones qu’ont été actvés sont marqués par c-Fos, après stim vis on peut quantifier cb de neurones ont rép au stim, y’en a + contro de marqués que ipsi, permet 1re aproximation à l’activité neuronale
●Tissu est fixé donc ne représente pas la «vraie» activité neuronale.
●Analyse à un moment déterminé ne représente pas la continuité ou la dynamique des changements («snapshot»).
●Nécessité de faire d’autres études pour démontrer que les changements observés sont pertinents

Question 6

Comment Évaluer la fonction cellulaire dans des tissus fixés?

Answer 6

• Incorporer un marqueur dans les cellules au cours de certaines fonctions cellulaires. Ces derniers indiquent la présence d’activité neuronale dans des examens histologiques subséquents.
• Technique normalement utilisée pour étudier la prolifération cellulaire et effectuer le suivi de protéines (protein tracking).

Question 7

Comment Évaluer la prolifération cellulaire avec des analogues de la thymidine?

Answer 7

• Le Bromodeoxyuridine(5-bromo-2’-deoxyuridine, BrdU) est un nucléoside analogue synthétique de la thymidine.
• Le BrdU est généralement utilisé pour détecter la prolifération cellulaire dans des tissus vivants.
• Les cellules qui sont en train de synthétiser l’ADN vont intégrer le BrdU dans leur ADN.
Les cell en prolif passent l’ADN avec BrdU aux cell filles et on détecte le BrdU avec des Ac
Les cellules BrdU positives peuvent être comparées avec celles marquées avec un anticorps contre Ki67 (marqueur endogène de prolif),un indicateur de prolifération cellulaire.
Compare même tissu avec 2 marqueurs de prolif pour confirmer que ya eut prolif et que BRDU a marché
Alternative à l’utilisation de BrdU:
Le 3H-thymidine («radioactive tritiatedthymidine») peut être utilisé pour marquer le nouvel ADN.

Question 8

Qu’est-ce que Fernando Nottebohm a fait?

Answer 8

• Il a fourni la preuve finale que la neurogenèsese produit dans le cerveau adulte des vertébrés, une notion considérée comme impossible auparavant.
• Il a accompli cet exploit en utilisant, notamment, la méthode de marquage au BrdU.

Question 9

Quels sont les Changements saisonniers de la taille du cerveau chez les oiseaux?

Answer 9

Changement taille cerveau est directement relié à activité neuronale
À la fin de l’hiver, le centre vocal desoiseaux était à sa plus petite taille (le moins de neurones), au cours du printemps, la structure changeait, la taille et nbre de neurones dans centre vocal changait et au mois d’août c’était à sa + grande taille et le cycle recommençait
Se demandait donc si c’était possible d’avoir prod de neurones entre fin hiver jusqu’à fin été
Chanter favorise la prolifération et la survie des nouvelles neurones dans le centre vocal
Pris 2 gr oiseaux qui ont reçu BRDU, injecte BRDU pendant 5 jr pour voir si ça incorporait dans cell en prolif, après oiseaux ont eu bcp de t pour chanter librement et après y’avait un gr qui pouvait continuer de chanter et l’autre gr pouvait pas chanter (dans cage couverte)
À la fin y’ont regardé nbre de cell marqués au BRDU dans le centre vocal et ont regardé l’hippo (a rien à voir avec le chant) et ils ont vue que les oiseaux qui pouvaient chanter (plasticité de neurones) avaient + de neurones marqués au BRDU et ll’hippo changait pas et les autres oiseaux avaient pas l’aug de prolif dans le centre vocal ==> preuve que ya neurogénèse dans cerveau adulte

Question 10

Comment Visualiser l’activité neuronale?

Answer 10

• Visualiser les changements de voltage
-Marqueurs sensibles au voltage
-Senseurs de voltage génétiquement encodés
• Visualiser les changements de calcium
-Marqueurs ratiométriques
-Marqueurs non-ratiométriques
-Senseurs de calcium génétiquement encodés

Question 11

Les enregistrements électrophysiologiques

Pourquoi pas?

Answer 11

Limitation:
Le «patch-clamp» est la technique de référence pour la mesure des signaux neuronaux. Cependant, cette technique n’est pas pratique pour mesurer la réponse d’un grand nombre de neurones simultanément.
Limitations pour comprendre le fonctionnement des circuits corticaux
Marqueurs qu’on peut intro dans bcp de neurones rend + facile l’étude de bcp de neurones à la fois

Question 12

Comment on visualise les changements de voltage?

Answer 12

Visualisation par des marqueurs sensibles au voltage (MSV)
(voltage-sensitive dyeimaging)
●Molécules fluorescentes (fluorophores) qui changent leur capacité d’absorption ou d’émission dépendant du potentiel de membrane du neurone.
●Cette technique permet la visualisation des changements de potentiel membranaire avec une fine résolution temporelle.
●Ces changements sont associés à l’ouverture et la fermeture de conductance membranaires (canaux ioniques).
●Grand nombre de marqueurs sensible au voltage avec différents propriétés de duration du signal, bruit de fond et toxicité.
Le changement de fluorescence est une excellente représentation du potentiel d’action (même chose que électrophys)
Mesure changements de voltage dans 3 compartiments du neurone, marqueurs sont pas limités à un positionnement comme électrophys est

Question 13

Quel est le Patron de l’activité cortical après stimulation des vibrisses ou stimulation électrique du cortex?

Answer 13

Marqueurs sensibles au voltage pour voir changements dans cortex somatosenso, stim vibrisses et voit rép dans cortex somatosenso et rép dans cortex moteur un peu après
Marqueurs sensibles au voltage reprod donc les changements électrophys dans le cerveau

Question 14

Quelles sont les 3 limites des MSV?

Answer 14

• Bruit de fond élevé (faible rapport signal/bruit)
• Absence de spécificité pour les différents types de neurones
• Difficulté pour les expériences d’imagerie a long-terme (plusieurs jours ou semaines)–faible durée d’action.
• Ces problèmes ont incité la création de marqueurs codifiés de façon génétique (MSV génétiquement encodés).

Question 15

Qu’est-ce que l’imagerie calcique?

Answer 15

• Le calcium est très importante pour beaucoup de processus biologiques (p. ex. libération de neurotransmetteurs, l’ouverture de canaux ionique, l’activation de plusieurs voies de signalisation intracellulaire et la survie neuronale).
• La dynamique du mouvement de calcium rentrant ou sortant de la cellule ainsi que le calcium intracellulaire peut être utilisé comme indicateur indirect de l’activité neuronale.
• Des exemples d’indicateurs à calcium fluorescents:
-marqueurs organiques dont la fluorescence augmente en se liant au calcium (ex. Fura-2, Fluo-4)
-GCaMP6 (senseur génétiquement encodé)

Question 16

Quels sont les 2 types d’indicateurs de Ca2+?

Answer 16

• Marqueurs ratiométriques

* Marqueurs non-ratiométriques

Question 17

Qu’est-ce qu’un fluorophore?

Answer 17

Les fluorophores changent leur fluo en liant au Ca2+

Même type de rép que microscopie fluo, ya une onde pour exciter et émet dans une autre onde

Question 18

Qu’est-ce qu’un marqueur ratiométrique?

Answer 18

• Les méthodes ratiométriques sont basés sur l’utilisation d’un rapport entre deux intensités de fluorescence.
• Les indicateurs ratiométriques montrent un changement dans leurs spectres d’émission lorsqu’ils se lient au calcium, ils peuvent donc être classés en tant qu’indicateurs à double émission ou à double excitation.
• La mesure du calcium avec ces composés est réalisée en utilisant deux lasers à excitation (s’ils sont des indicateurs à double excitation) ou deux plages de détection (dans le cas d’indicateurs à double émission).

Double émission: On remplit un neurone de marqueurs de Ca2+, quand ya pas de Ca2+ le marqueur a une intensité de fluo et quand lie Ca2+, intensité de fluo change, mais l’onde d’excitation est la même
Ce qui change est l’intensité de fluo lors de l’émission (lié vs non lié)
Ratio = intensité lié/intensité libre, ratio permet d’estimer conc de Ca2+ dans cell et voir changements de Ca2+ dans les diff conditions

Double excitation: Mesure rép tjrs à une longueur d’onde mais l’excitation est diff dépendant de la liaison au Ca2+
Cell en culture, remplit de marqueur, utilise 2 ondes d’excitation et mesure l’émission à une lambda, compare fluo émise avec les 2 ondes d’exci donc permet de voir diff niveaux d’intensité (intensité est + élevée quand marqueur est lié au Ca2+)
Peut faire courbe de calibration ou ajoute une qté connue de Ca2+ et mesure intensité comme ça on peut estimer la conc numérique

Question 19

Quel est l’avantage et les 2 limitations d’un marqueur ratiométrique?

Answer 19

Avantage: L’utilisation du ratio 340/380nm annule automatiquement les variables (ex. concentration de marqueur, épaisseur des cellules) faisant de Fura-2 l’un des outils les plus appréciés pour quantifier les niveaux de calcium.
Limitations: •L’acquisition et la manipulation des données sont plus complexes en raison de l’utilisation des rapports de fluorescence.
•Tous les microscopes ne conviennent pas à ce type de mesures car c’est nécessaire d’avoir 2 longueurs d’ondes d’excitation ou d’émission.

Question 20

Qu’est-ce qu’un marqueur non-ratiométrique, son avantage et ses 2 limitations?

Answer 20

• Démontrent une relation directe entre les changement de la concentration du calcium et l’intensité de la fluorescence émise.
Avantage: Utilisation et
quantification facile du signal.
Limitations:- Pas possible de cibler des populations spécifiques de neurones
- Les marqueurs peuvent changer
l’homéostasie calcique dans la cellule en liant le calcium intracellulaire.

Question 21

L’Imagerie calcique avec les marqueurs Fluo se fait comment?

Answer 21

Cette technique permet de mesurer les changements d’intensité de la fluorescence au cours du temps (F) par rapport au niveau basal (F0).
• Ces réponses sont utilisées pour créer des cartes pseudo-coloriées pour montrer les changements dans l’espace et le temps F/F0(rouge/jaune: large changement, bleu/mauve: petit changement).
• Les indicateurs de calcium produisent des signaux plus larges et robustes que les marqueurs de voltage mais avec une résolution temporelle plus basse (millisecondes en lieu de microsecondes).

Question 22

Qu’est-ce qu’un Senseur de calcium génétiquement encodé?

Answer 22

GCaMP est un marqueur génétiquement encodé qui mesure directement les changements d’intensité de fluorescence causés par un changement de conformation sensible au calcium.
GFP + CAM (lie Ca2+ avec grosse affinité) et M13
Quand ya pas de Ca2+ lié, ya pas de fluo pcq GFP est bloqué dans une confo que peut pas être fluo mais dès que ya du Ca2+ qui lie, ya changement confo de tout le complexe mais surtout le GFP qui pourra émettre de la fluo proportionnelle au Ca2+ lié qui est proportionnel au Ca2+ dans le syst
Lorsqu’il est lié au calcium, le GCaMP émet une fluorescence verte avec une longueur d’onde d’excitation maximale de 480nm et une longueur d’onde d’émission maximale de 510nm.
Les premières souris transgéniques contenants GCaMP ont été générées l’année 2004. Depuis ce temps les GCAMP ont été progressivement améliorés pour augmenter le rang des signaux fluorescents (GCaMP3 à GCaMP8). GCaMP6 est le plus utilisé en neurosciences.
Peut implanter un objectif et marquer les neurones pour visualiser le Ca2+ pour mesurer changements calciques in vivo dans des animaux en mvmt
Combine marqueurs génétiquement encodés avec microscopie à 2 photons donc peut voir dynamique calcique dans animaux vivants

Question 23

Quel est l’avantage et les 2 incovnients des Senseurs de calcium génétiquement encodés?

Answer 23

Avantages: -Spécificité du ciblage (promoteur spécifique)
Limitations: -Peuvent présenter de très long signaux décroissant
dans le temps. Ceci donne une très faible résolution temporelle. Les versions GCaMP6 et plus sont améliorées.
-Le tamponnage du calcium intra cellulaire peut altérer les voies de signalisation, si présent à haute
concentration.

Question 24

Comment on peut faire la Manipulation optique de l’activité neuronale et quels sont ses 3 avantages?

Answer 24

• Méthodes optiques (activés par la lumière):
-Stimulation par la libération des molécules («uncaging»)
-Canaux activés par la lumière
Avantages
• Permet de cibler de sous-types de neurones (ciblage génétique)
• Permet de cibler une large population neuronale
•Diminue les effets non-spécifiques causés par la stimulation
électrique.

Question 25

Qu’est-ce que la Stimulation par la libération des molécules («uncaging»)?

Answer 25

• Une variété de composés peuvent être encagés en ajoutant un groupe chimique pouvant être libéré par la lumière. Le composé encagé ne possède pas les propriétés actives du composé seul.
NT mod pour être inactifs mais quand stim lum avec une certaine lambda, on peut éliminer la partie inhi (la cage) et libérer une forme active de la molé
Modulateur lié à sa cage pourra pas lier son récepteur donc pas d’activité mais avec bon lambda on peut briser lien avec la cage et modulateur pourra lier récept et déclencher une cascade de signalisation
Permet de très finement réguler la conc de glut dans une cell et administration très locale de NT

Question 26

Quels sont les 2 canaux activés par la lum?

Answer 26

Opsines

• Channelrhodopsine-2 (ChR2): Canal cationique qui permet le passage de sodium après illumination avec lumière bleue (excite/dépola)
• Halorhodopsine(NpHR): Lum jaune cause inhi de la rép neuronale pcq hyperpola neurone en faisant passer Cl-

Question 27

L’optogénétique sert à étudier quoi?

Answer 27

Optogénétique: pour étudier le code neuronal dans un circuit cortical
Mesure rép endogènes de neurones mais aussi manipuler les neurones et voir qu’est-ce qui se passe si on active ou inhibe certains neurones