Cours 4

Question 1

Qu’est-ce que l’électroophysiologie?

Answer 1

L’électrophysiologie est le domaine des neurosciences qui explore l’activité électrique des neurones vivants et étudie les processus moléculaires et cellulaires qui régissent leur signalisation

Question 2

Décrit les propriétés électriques du neurone

Answer 2

Na+: 70mV gradient électrostatique vers l’int et 50mV gradient de conc vers l’int
K+: 70mV gradient électrostatique vers l’int et 90mV gradient de conc vers l’ext
Cl-: 70mV gradient électrostatique vers l’ext et 70mV gradient de conc vers l’int
Pompe Na+/K+

Question 3

Quel est le pot de repos d’un neurone?

Answer 3

+ neg à l’int, canaux ioniques importants ur pot repos = canaux K+ car ont conductance, gradient de conc vers l’ext et force électrique pousse K+ vers l’int, quand les 2 F sont à l’eq, ya le pot repos qui est à -60 à -75 mV
Si les autres canaux ouvrent, ça change l’int de la cell
Les canaux sodiques jouent pas dans le pot de repos normalement
Pot de repos est déterminé par nbre de diff canaux ouverts et leur pot d’eq

Question 4

Qu’est-ce qu’un potentiel d’équilibre?

Answer 4

Pot ou si ya ouverture d’un canaux, l’influx et l’eflux de l’ion est exactement le même (meme qté de l’ion rentre que c’qui sort)

Question 5

Quel est le potentiel d’équilibre du Na+, du K+ et du Cl-? Comment ça affecte le potentiel de repos?

Answer 5

Na+: +55mV
K+: -75mV = env pot repos
Cl-: -60mV = env pot repos
Si canaux Cl ou K+ ouvrent au pot repos, ya pas grand chose qui se passe
Pour le Na+, Na+ extracell est bcp + que int donc au pot repos si canaux Na+ ouvrent ya influx de Na+

Question 6

Quel est le potentiel de repos du Ca2+, quel est son rôle?

Answer 6

Env +100mV
Le rôle du Ca2+ est pas de changer le pot, il est là pour être un messager secondaire, le Ca2+ libre dans les cel = messager secondaire donc si ya canauxCa2+ ouverts et qui passent du Ca, c’est pas pour induire un pot mais pour transmettre un message, puisque Ca fait signalisation, sa conc intracell est presque 0
Dans toutes les situations, quand canal Ca2+ ouvre, du Ca rentre

Question 7

Qu’est-ce qu’un PPSE? Et un PPSI?

Answer 7

Syn excitatrice: canaux Na post syn, NT excitatoire = glutamate, lie canaux post syn, cause influx Na qui dépola = PPSE

NT = GABA, lie canaux Cl- et les ouvre, pot d’eq du Cl = pot repos donc pas grand chose se passe, mais si y’avait une dépola avant l’ouverture des canaux Cl, le pot va diminuer lors de l’ouverture des canaux Cl = PPSI

Question 8

Qu’est-ce qu’un PA?

Answer 8

Somation de toutes les dépola au niveau des dendrites et le pot passe vers le soma, entre le soma et l’axone ya le trigger zone ou le PA est généré pcq ya des canaux sodiques Vd (grande densité) dans cette région là et le seuil pour induire PA là est dim; dépola active les canaux NaVd qui active le prochain et ainsi de suite qui ensemble permettent le phénomène tout ou rien
La dépola se déplace vers le soma (back prpagating PA, fait changements syn dans dendrites) mais desc aussi axone et dans noeuds de Ranvier fait PA
Avec PA ya une dépola et après une repola, les canaux responsables sont les canaux NA et K
Cnductance Na+: Vd, influx de Na et dépola
Conductance K+: Vd, avec dépola et délai d’ouverture à cause de la dépola, le pot cell est à +30 donc à ce moment là si canaux K+ ouvrent, ya une grande diff entre pot de cell et pot eq du K+ donc ya une grande conductance pour le K+
Dans certains time points des PA, ya des ions spécifiques qui sont responsables pour les diff phases (Na+ en 1er et K+ après)
Tard dans le PA, les canaux Na+ sont inactivés (les canaux Na ont 3 phases) et on doit hyperpola avant de pouvoir les réouvrir

Question 9

Qu’est-ce que la perfusion?

Answer 9

Perfusion de la chambre d’enregistrement avec une solution d’électrolytes: par exemple avec de l’ACSF (artificial cerebro spinal fluid = solution cérébrospinale artificielle)

Question 10

Qu’est-ce qu’une microélectrode (électrode d’enregistrement)?

Answer 10

Les électrodes de verre remplies avec une solution d’électrolyte:
 2 3M KCl ou K acétate pour le type de « sharp » électrodes (pour les enregistrements intracellulaires); pcq très peu d’échanges entre ce que ya dans pipette et int de la cell
 NaCl ou ACSF pour les électrodes extracellulaires (enregistrements extracell); même composition que ce que ya dans la chambre d’enregistrement
 Solution « intracellulaire » pour les électrodes de « patch clamp » (enregistrement de façon cellule
entière); microélectrode est en continue avec le cyto donc sltion doit ressembler ce que ya dans le cyto

Les électrodes en métal servent aux enregistements in vivo
À chaque jour doit prod nouvelle électrode d’enregistrement

Question 11

Qu’est-ce qu’une électrode de stim?

Answer 11

Une électrode de stimulation est utilisée pour appliquer un courant électrique à un tissu ou des cellules
Si fait ek enregistrer, on va p-e de temps en t enregistrer des PA, mais on veut stim des axones pour pouvoir enregistrer rép du neurone à la stim
Utilise même électrode de stim pour des semaines

Question 12

Qu’est-ce qu’un étireur (puller)?

Answer 12

Utilisé pour prod électrodes d’enregistrement (micro électrode)
On peut attacher un tube de verre fin de chaque côté et le passe vers le filament
Ya une tension des 2 côtés du tube et on chauffe l’étireur ou ya le filament et à ce moment là, 2 électrodes d’enregistrement sont produits

Question 13

Qu’est-ce qu’un préamplificateur (headstage)?

Answer 13

Le préamplificateur est le premier niveau de détection de signal. Il transmet le signal vers l’amplificateur.

Question 14

Qu’est-ce qu’un électrode de référence (bath electrode)?

Answer 14

Sert à déterminer changements au niveau du neurone, référence = 0 donc compare tous les changements avec l’électrode de bain

Question 15

Le support à pipette comprend quoi? (5)

Answer 15

Contact électrique, 2 joints hermétiques, fil électrode, canal pour appliquer une pression (pour faire patch-clamp) et l’électrode d’enregistrement (contient sltion dépendament de type d’enregistrement)

Question 16

Comment le courant circule dans la pipette?

Answer 16

Si ya un courant qui passe dans le neurone, le courant passe vers la sltion dans l’électrode, ya un fil qui est dans la sltion de l’électrode courant va dans fil et courant fait contact avec le contact électrique qui est inséré dans le préamplificateur, ensuite le courant va vers l’amplificateur et ensuite on peut le voir dans l’ordi

Question 17

Qu’est-ce que le microdrive?

Answer 17

Pour positionner l’électrode dans le tissu (dans la cell ou à côté). Il est contrôlé par un micromanipulateur pour éliminer les vibrations

Question 18

Qu’est-ce que le micromanipulateur?

Answer 18

Le micromanipulateur contrôle le microdrive . Il permet un positionnement précis de la microélectrode. Des mouvements fins sur les axes X, Y et Z. (par exemple des mouvements fins de 0,1 micromètre)

Question 19

Que sont l’amplificateur et l’interface analogue-digitale?

Answer 19

 L’amplificateur amplifie le signal du préamplificateur. En plus, il exécute les changements imposés par l’expérimentateur (Ex voltage imposé).
 Interface analogue digitale: le signal analogique de l’amplificateur est digitalisé pour l’ordinateur

Question 20

Qu’est-ce que le stimulation isolation unit?

Answer 20

Dans le but d’améliorer le bruit électrique, l’amplificateur va stimuler l’électrode de stimulation vers une unité électriquement isolée, le “Stimulation isolation unit” (le pulse électrique généré via “l’unité d’isolation” est possible grâce à la décharge d’une batterie).
On enregistre en pA donc tout le bruit électrique, on le voit, c’est aussi pq on a une cage de Faraday, pour dim le bruit électrique on untilise le stim isolation unit qui n’est pas connecté à une prise mais utilise des batteries (source électrique = batterie)
Bruit provient de prise électriques donc utilise batterie pour pas l’avoir

Question 21

Qu’est-ce que l’oscilloscope?

Answer 21

L’oscilloscope affiche le signal provenant de l’amplificateur.
Cependant, de nos jours ce n’est plus fait par l’oscilloscope, mais par l’ordinateur dans la plupart des cas

Question 22

Le microscope sert à quoi?

Answer 22

Le microscope est nécessaire pour placer l’électrode de stimulation et la microélectrode. Faible grossissement pour les enregistrements extracellulaires et fort grossissement pour les enregistrements intracellulaires et patch clamp.

Question 23

L’ordi sert à quoi?

Answer 23

Les ordinateurs permettent d’écrire des programmes de stimulation, d’enregistrer les réponses des neurones et d’analyser les données acquises.

Question 24

La cage de Faraday sert à quoi?

Answer 24

La cage isole le poste d’électrophysiologie contre le bruit électrique de l’extérieur (par exemple des pompes électriques à proximité , téléphones cellulaires, etc.).

Question 25

La table anti-vibrations sert à quoi? Elle est faite comment?

Answer 25

La table anti vibrations permet le placement des électrodes sans interférence avec les vibrations (la table est lourde et repose sur de l’air sous pression).

Question 26

Qu’est-ce qu’un enregistrement in vitro? Quels sont les 3 types de préparations possibles?

Answer 26

Les préparations de culture in vitro offrent un accès physique et visuelle inégalée à des cellules individuelles, permettant des études détaillées sur les molécules et les protéines qui affectent la physiologie neuronale.
On contrôle les médias d’incubation ou la solution de bain (par exemple, on peut tester les effets de substances pharmacologiques dans le bain).
 des systèmes d’expression hétérologue
 les cellules primaires isolées
 des tranches de cerveau

Question 27

Qu’est-ce qu’un syst d’expression hétérologue?

Answer 27

Des exemples de systèmes d’expression hétérologues sont des ovocytes de Xenopus laevis , des cellules ovaire de hamster chinois (CHO) et des cellules de rein embryonnaire humain (HEK 293T).
• facile à transfecter pour faire exprimer la protéine d’intérêt (par exemple, un canal ionique)
• la protéine d’intérêt n’est normalement pas exprimée de manière endogène
• la machinerie moléculaire pour le transport membranaire, l’assemblage des protéines et des modifications post transcriptionnelles pourraient être absent

Question 28

Qu’est-ce que la méthode de cell primaires isolées, ses avantages (3) et désavantage?

Answer 28

Les cultures de neurones dissociés à partir d’une région d’intérêt (par exemple, le cortex, l’hippocampe, la moelle épinière etc).
Avantages:
 on peut étudier la protéine exprimée de manière endogène (par exemple un des canaux ioniques).
 très bonne visibilité de la cellule pour patch clamp
etc.
Drogues pénètrent facilement
Désavantages:
• les cellules forment des connexions synaptiques
en culture. Cela ne représente pas des connexions neuronales normales dans un circuit

Question 29

Qu’est-ce que la méthode des tranches de cerveau, ses avantages (3) et ses désavantages (3)?

Answer 29

Des cultures de coupes de tissus entiers. Cultures aigus conservés pendant des heures ou jusqu’à plusieurs semaines.
Avantages:
 enregistrements intracellulaires plus facile que in vivo (le tissu ne bouge pas!)
 rôle des neurones dans un circuit peut être étudié (circuits et syn sont conservés)
 cultures à long terme permettent l’expression de protéines ectopiques (via virus, canon à gènes, etc.)
Désavantages:
 Visibilité pire qu’avec des cultures isolées primaires
 substances pharmacologiques ajoutés au bain doivent pénétrer dans le tissu
 connectivité synaptique pourrait changer dans les cultures à long terme

Question 30

Quels sont les 3 types de techniques d’électrophysiologie?

Answer 30

l’enregistrement extracellulaire
▪ l’enregistrement intracellulaire
▪ patch-clamp

Question 31

Qu’est-ce que l’enregistrement extracell, ses avantages, ses désavantages, la sltion et le type d’électrode utilisé?

Answer 31

Les enregistrements extracellulaires mesurent les différences de potentiel sur la surface extérieure d’un neurone actif (la ddp entre la fin de la microélectrode et une électrode de référence).
 Avantages: relativement facile à faire
 Désavantages: impossible de mesurer des événements sous le seuil (« sub threshold ») d’une
seule cellule.
 Mais , la réponse synaptique de nombreux neurones produit des potentiels de champ local mesurables (les potentiels de champ locaux = la somme de l’activité synaptique de nombreux neurones)
On a besoin d’avoir une sltion d’aCSF dans l’électrode, l’électrode a une très grande ouverture (3-5 mega Ohms) pcq on veut mesurer la rép de +ieurs neurone
Types des électrodes: Seulement une microélectrode extracellulaire ou plusieurs groupements d’électrodes

Question 32

Un PA ressemble à quoi en enregistement extracell?

Answer 32

Ions + sont + concentrés à l’int donc l’ext est négatif donc quand Na+ rentre, pot extra cell dim encore + et quand K+ commence à sortir, pot extracell commence à aug
Vollée afférente: PA arrive au terminaisons et ouvre canaux NA et dépola présyn (perte d’ions extra cell)
Pot de champ local: NT est relâché et Na+ commence à rentrer post syn donc perd encore + d’ions post syn
Entre les 2 = t que ça prrend pour NT d’aller de pré à post syn

Question 33

Qu’est-ce qu’un enregistrement intracell, ses avantages et désavantages?

Answer 33

Les enregistrements intracellulaires détectent les petits changements du potentiel de membrane locale causés par des événements synaptiques.
Le microélectrode empale le neurone
Bout de l’électrode est très très fin, ya presque pas d’échange de sltion dans l’électrode et le cyto; si y’avait bcp d’échanges la cell exploserait car gonflerait d’eau), l’électrode est tellement fin que ya vrm pas bcp de courant qui y passe donc on doit aug la sensibilité d’enregistrement et on fait ça en aug la conc des ions dans la sltion dans l’électrode (aug F de conc, conc de 2-3M);
Avantages: échange minimale de la solution de la pipette avec le cytoplasme
Désavantages: difficile à réaliser avec les petits neurones et enregistrement en voltage imposé impossible (on a besoin de deux électrodes)
La plupart des chercheurs qui ont utilisés des enregistrements avec des électrodes « sharp » ont opté pour des enregistrements de façon cellules entières avec la technique de « patch clamp ».

Question 34

Qu’est-ce qu’un enregistrement en patch clap et les 5 configurations?

Answer 34

La micropipette est approchée au contact de la membrane plasmique du neurone. Une légère succion exercée à l’intérieure la pipette entraîne la formation d’un contact très étroit entre la membrane et la pipette (“giga ohm seal)
Cette technique permet une isolation électrique du morceau de membrane sous la pointe de la pipette.
Les différentes configurations d’enregistrement:
 pipette attachée à la cellule (« cell attached configuration »)
 cellule entière (« whole cell configuration »)
 extérieur extérieur (« outside out configuration »)
 intérieur extérieur (« inside out configuration »)
 le patch perforé

Question 35

Qu’est-ce que la méthode cell-attached, ses avantages (3) et ses désavantages (2)?

Answer 35

Fait contact fort avec memb, très étroit, pipette est attachée seulement à la memb
Avantages
 facile
 le milieu intracellulaire reste intact (pas d’échanges entre sltion de pipette et cyto)
 possibilité d’enregistrer un seul canal ionique
Désavantages
 on ne contrôle pas le milieu intracellulaire
 la valeur du potentiel à la membrane n’est pas connue (on sait pas si ya des dépola ou hyperpola)

Question 36

Qu’est-ce que la méthode inside-out?

Answer 36

Tire sur la pipette à la place de sucction, ya rupture et à cause de la forte attachement sur la memb, la meemb brise et ce que y’avait à l’int de la cell devient à l’ext
Le milieu « intracellulaire » est le milieu du bain et le milieu extracellulaire est le milieu à l’intérieur de la pipette . Donc, on peut changer rapidement le milieu
« intracellulaire » avec un système de « fast step perfusion » pour tester l’effet de différents agents pharmacologique, des « second messanger » etc.

Question 37

Qu’est-ce que la mthode whole-cell, ses avangates (2) et désavantage?

Answer 37

si on fait sucction assez forte, fait trou dans memb et cyto et pipette deviennent au continuum, on a accès au cyto et on peut déterminer le pot, on peut manipuler la cell
En whole cell, ya échanges entre cyto et sltion de la pipette (fuite de pipette)
Avantages
 enregistrement du voltage imposé ( le contrôle du potentiel de membrane est excellente en raison de la “grande” ouverture de la pipette)
 échange entre le cytoplasme et la solution de la pipette: certain contrôle de la composition du milieu intracellulaire
Désavantages
 échange entre le cytoplasme et la solution de la pipette: la perte de constituants intracellulaire (« wash out »); peut causer prob pour plasticité syn; après 10 min ya washout donc rend potentialisation à long terme est difficile à induire, faut le faire vrm vite
On enregistre pas yek un canal, un rép syn est la somation de bcp de canaux et ça nous permet de faire des courbes

Question 38

Qu’est-ce que la méthode outside-out?

Answer 38

on était en whole cell et on tire sur la pipette, la memb rupture (interaction entre mbm et pipette est + tuff que memb) et puisque memb est hydrophobe, elle se rattache et ce que y’avait à l’ex reste à l’ext
Le milieu « intracellulaire » est le milieu à l’intérieur de la pipette et le milieu extracellulaire est le milieu du bain. Donc, on peut changer rapidement le milieu extracellulaire avec un système de « fast step perfusion » pour tester l’effet de différents agents pharmacologique, des agonistes, des antagonistes etc.

Question 39

Qu’est-ce que la méthode de patch perforé? Quel est son utilité?

Answer 39

Le patch perforé: la solution de la pipette contient un produit chimique qui provoque de petites perforations dans la membrane. Cela permet petite conductance ionique mais pas de fuite du cytoplasme.
On fait cell attached, et drogue s’insère dans memb, drogue = canaux ioniques qui laissent seulement certains ions passer et avec des échanges de ces ions, on peut enregistrer des changements intra cell à cause des changements extra cell (dans la pipette)
Ça sert à mesurer la conductance du Cl, conc de Cl dans bébés est + haut intra cell que extra cell donc ouverture de canaux Cl dans bébés = signal excitatoire, le syst d’inhibition chez les bébés est pas dév (ont + de chances d’avoir épilepsie), mais dans adultes est l’inverse
si on veut tester canaux Cl de cell en dév, on peut pas utiliser whole cell pcq Cl va sortir, donc on utilise perforated patch

Question 40

Quelle est la règle de traçage en voltage imposé?

Answer 40

En voltage imposé, un courant positif entrant dans le neurone est toujours tracé vers le bas.
Tracé vers le haut pout récept GABA car fait renter du Cl (même chose que sortie d’ions +)

Question 41

Quelles sont les 17 étapes d’un enregistrement en patch clamp?

Answer 41

 Tirez une pipette (3 5 MOhm de résistance) et remplissez la avec la solution “intracellulaire”.
 Début de la perfusion de la chambre d’enregistrement avec de l’ACSF (température constante de l’ACSF est nécessaire!).
 Mettez la tranche dans la chambre d’enregistrement.
 Placez vos électrodes de stimulation.
 Placez la pipette d’enregistrement dans le ACSF dans la chambre d’enregistrement.
• appliquer une pression positive
• vérifier si des bulles d’air obstruent la pointe de la pipette
• mis à 0 mV
Le système impose une impulsion voltage rectangulaire pour calculer la résistance de l’électrode
d’enregistrement
• approcher le tissu
• positionner l’électrode à côté du neurone
• approcher la membrane avec soin et regarder pour la formation d’une fossette
• relâcher la pression et appliquer un peu de succion
• vérifier un joint giga Ohm
Vérifier que tous les paramètres sont bons
Il est important d’observer le ratio de Rm vs. Ra
Et voilà: nous pouvons enregistrer la réponse synaptique lors de la stimulation

Question 42

Qu’est-ce qu’un événement miniature spontané?

Answer 42

Enregistrements d’vènements miniatures spontanés; on bloque tous les canaux sodiques avec TTX donc on peut pas induire de PA donc si le bruit est assez petit, on peut enregistrer des petites rép qui sont des fusions accidentelles de la memb présyn et une vésicule et la rép post syn causée par une seule vésicule; pas une transmission d’info mais est une signalisation au neurone post syn que le neurone présyn est là et qu’il fctionne
Si une drogue aug de l’amplitude des événements spontanés, on sait que la drogue affecte les récept post syn
si ya des changements de f; c’est un mécanisme présyn pcq c’est les vésicules qui sont affectées