Cours 6 Flashcards
Quelles sont 4 techniques de visualisation de la structure du SN?
Préparation de tissus
Visualisation de structures
Visualisation d’expression des gènes et protéines
Visualisation des circuits
Pourquoi étudier la structure du SNC? (2)
Générer des hypothèses concernant la fonction des différents neurones
Savoir comment ils influencent les circuits neuronaux et comportementaux
Quelle était la théo de Cajal?
De la structure à la fonction
Les neurones sont les unités structurelles et fonctionnelles de base du système nerveux.
Quelles sont les 4 principes de la doctrine neuronale?
le neurone est l’unité structurelle et fonctionnelle fondamentale du système nerveux
les neurones sont des cellules discrètes qui ne sont pas continues avec d’autres cellules
le neurone est composé de 3 parties –les dendrites, l’axone et le corps cellulaire
l’information circule le long du neurone dans une direction (des dendrites à l’axone, via le corps cellulaire)
Comment se fait la préparation des tissus? (4 grandes étapes)
Le tissu neural est délicat et dégradable
Il est nécessaire de préserver le tissu quasi in vivo
Les 4 grands étapes:
Fixer
Disséquer
Envelopper
Faire des sections
Comment se fait la fixation? Pourquoi on le fait?
Utilisation des produits chimiques pour préserver, stabiliser, et renforcer l’échantillon pour en faire des analyses microscopiques
◦Renforcer les interactions moléculaires
◦Désactiver les enzymes protéolytiques
◦Éliminer les microorganismes qui les dégradent
Quels sont 2 types d’agents de fixation?
«cross-linking»: ◦Formation des liaisons covalentes Les aldéhydes: formaldéhyde, para formaldéhyde, glutaraledéhyde Usage: microscopie photonique Osmium tetroxide(oxydation) Usage: microscopie électronique
Déshydratation:
◦Perturbation des lipides, réduction de la solubilité des protéines
Méthanol, acétone
Quels sont 2 modes de fixation?
Immersion:
◦Temps requis dépend de la taille/épaisseur du tissu
Perfusion transcardiaque:
◦Par pénétration du ventricule gauche
Comment se fait la dissection? (3)
retirer le cerveau du crâne
microdisséquer les régions d’intérêt, si nécessaire
◦la decision est basée sur le type d’analyses qui suivent
Comment se fait la cryopréservation? (3)
Le tissue est submergé dans un solution de 30% sucrose pour 48-72hr
l’eau peut endommager les tissus à la congélation
Le sucrose remplacel’eau, le tissu devient moins flottant
L’enveloppement sert à quoi? Quels sont 4 exemples d’agents utilisés?
Stabiliser la structure du tissu Faciliter les coupes ◦OCT ◦Gélatine ◦Paraffine ◦Plastique
Comment on fait des sections? (3 machines et leurs caractéristiques)
Microtome
Congelé ou non-congelé
OCT, paraffine, plastique
Section moyenne: 25-100 μm
Cryostat
Congelé
-20C à -30C
Section mince: 10-50 μm (je fais 7 μm)
Vibratome Lame vibrante Non-congelé Possibilité d’utiliser avec des tissus vivants Section épaisse: 100-400 μm
Quelles sont les 3 coupes possibles?
Coronale
Sagittale
Horizontale/Transverse
avant de faire l’enveloppement, il fait décider quels coupes on va faire pcq fait enveloppement diff selon plan de coupe
Comment se fait la visualisation des morpho? (4)
75% de la masse du cerveau est composée d’eau
Les sections sont transparentes!
Il est nécessaire d’avoir un contraste entre les structures spécifiques pour les distinguer des structures aqueuses
Utilisez des colorants pour visualiser les structures
Quels sont les colorants du soma?
Colorants basophiles ◦pH>8 (basique) ◦Marque des molécules acides (ADN, ARN) Noyaux et ribosomes ◦Les exemples non-fluorescents: Cresylviolet (Nissl) Hematoxyline Thionine Les teintures Nisslpréfèrent l’ARN (RER, ribosomes) qui est plus abondant dans les neurones Fluo: Marqueurs des noyaux par l’intercalation entre les spirales hélicoïdales de l’ADN DAPI Hoechst (bisbenzamide) Propidiumiodide
Les teintures basophiliques permettent quoi? (2)
◦l’examen de l’architecture cellulaire
◦La visualisation des aspects macroscopiques des régions distinctes du cerveau
Qu’est-ce qu’un colorant des fibres? (3)
Marque la myéline de la matière blanche
Utilisé en combinaison avec des colorants basophiles sur des sections adjacentes
Attention: impossible d’identifier des fibres individuelles
Qu’est-ce que la coloration de Golgi (2 avantages et un désavantage et l’utilité)?
Marque complètement des neurones individuels et leurs processus
2 avantages:
◦Les neurones sont marqué complètement (soma, axones*, dendrites)
c’est idéal pour visualiser le champs dendritiques
◦Seulement de 5 à 10% des cellules totales sont colorées
Désavantage:
◦Ne peut pas contrôler les neurones marqués
•Utiles dans les études de la neurodégénérescence
*Golgi ne marque pas tout l’axone (il n’y a pas un accumulation dans les axones myélinisées mais il peut marqué les axones terminales et non-myélinisées.)
Le marquage intracell permet quoi? Donne un exemple de marqueur et son utilité
Permet de faire le lien entre les structures et les zones du cerveau avec l’activité ou la fonction du neurone dans le cerveau
Neurobiotine injectée dans un neurone vivant.
On peut fixer et faire l’analyse histologique après les enregistrements d’activité
Comment fctionne le marquage fluo intracell? (3)
Génétique: expression des fusion de GFP et variantes
Fluorophores: Alexa488, Rhodamine, Cy5
Possiblilitéde faire une amplification (ie. Il n’y pas de relation1:1)
Qu’est-ce que la technique quantum dots?
nanocrystauxsemi-conducteurs, résistants au photobleaching
Convertissent un spectrum de lumière en diff couleurs
+ grand dot = + grande longueur d’onde (rouge), plus petit = bleu
Comment fctionnent les méthodes de marquage avec sonde? (2)
Une sonde (ex. anticorps ou brin antisense) n’est pas visible en elle-même
Doit être conjugué à un marquage qui peut-être visible par lui-même OU peut-être réactif avec d’autres produits chimiques pour rendre un produit visible
Qu’est-ce que le marquage chromogénique? Donne 4 exemples
Réaction enzymatique avec un substrat qui produit un composé coloré et visible par microscopie photonique
◦Horseradishperoxidase(HRP) ►brun/noir
◦B-galactosidase/X-Gal ►bleu
◦Conjugaison de Biotin avec avidin/streptavidine
◦Digoxigenin
Qu’est-ce que le marqueur biotine? (5)
Soluble
Non-toxique
Iontophorèse facile
Livraisonpar un courant électrique comme on stimulerait un neurone
Reste dans la cellule
On peut visualiser avec des marqueurs conjugués avec avidine, en microscopie photonique, fluorescente et électronique
Quels sont 2 autres méthodes de marquage intracell?
Radioactif ◦Réaction directe: marquage de 1:1 ◦Utile pour la localisation des récepteurs, la prolifération et le trafic des protéines Or ◦Matériaux dense aux électrons ◦Microscopie électronique
Comment on fait la visualisation des gènes et prot?
Hybridization«In situ»
◦Méthode pour visualiser les acides nucléiques
ADN et ARN sont possible
◦Déterminer quandet ouun gène spécifique est exprimé
◦Limitation PLUS importante: impossible de savoir où la protéine fonctionnelle est exprimée dans la cellule
Comment on fait l’ISH ARNm? (4)
Il faut connaître la séquence génétique de l’ARNm
Faire une sonde d’acide nucléique simple-brin complémentaire («anti-sense»)
Marquer la sonde pour la détection (nucléotides radioactifs, etc)
Mettre la sonde avec le tissus: faire un duplex de sonde et ARNm
Quels sont 3 contrôles importants de l’ISH?
Une sonde «sens»
Autres sondes faites pour des régions différentes du même gène/transcrit
Possibilité de présences de fluorescence (FISH)
Qu’est-ce que le Allen Brain Atlas?
catalogue de tous les transcrits dans le cerveau
visualisation de l’expression d’ARNm dans toutes les coupes, comme ça on a pas tjrs besoin de faire l’hybridation nous mêmes, ils l’ont déjà fait
Comment on fait la détection des prot par immunohistochim? (3)
Méthode de visualisation des protéines et autres biomolécules
Avantagepar rapport à d’autres méthodes: visualisation des protéines dans les structures subcellulaires (résolution spatiale)
◦Immunohistochimie: tissus
◦Immunocytochimie: cellules
◦Immunofluorescence: avec la détection fluorescente
Effectuée grâce à des anticorps
Qu’est-ce qu’un Ac? (4)
Anticorps monoclonal: Reconnait un epitope d’antigène
Anticorps polyclonal: Reconnait plus d’un epitope d’antigène
Produits dans des lignées cellulaires spécialisées ou les animaux vivants
L’optimisation est spécifique pour chaque anticorps ET chaque application (exp)
Qu’est-ce que la méthode IHC?
Tissu/cellule fixée
Anticorps primaire: spécifique pour la protéine ciblée
Détection:
Directe IHC;
conjugaison de fluorophore/enzyme chromogènique
Indirecte IHC:
utilise un anticorps secondaire conjugué de fluorophore/enzyme chromogénique
Amplification de signal: c’est quand plus d’un anticorps secondaire peut reconnaitre l’anticorps primaire
Comment vérifiez-vous la spécificité de votre anticorps? (2)
Un contrôle positif
◦Un spécimen qu’on connait peut contenir l’antigène
Des contrôles négatifs
◦Un spécimen qu’on connait qui ne contient pas l’antigène
◦Pré-incubation de l’anticorps avec un antigène avant mise en présence du spécimen
Déplétion d’anticorps….totalement associé à sa cible
◦IHC indirecte: un spécimen incubé sans l’anticorps primaire mais seulement avec l’anticorps secondaire
Vérification qu’il n’y a pas d’association non-spécifique
Quels sont les 4 facteurs qui influencent l’IHC?
IHC est simple…mais le signal peut-être affecté par plusieurs facteurs
◦Méthode de fixation
◦Concentration d’anticorps
◦Durée de temps d’incubation de l’anticorps avec le spécimen
◦Accessibilité de l’antigène
Qu’est-ce que l’histochim enzymatique? Elle identifie quoi? Donne un exemple
Utilisation de l’activité enzymatique endogène
Obtention de sous-produits coloré après incubation avec des chromogènes
Identification des neurones métaboliquement actifs
Cytochrome c oxidase: marque mito et barrel cortex est très actif métaboliquement donc marque bcp
Qu’est-ce qu’un gène rapporteur?
Pourquoi les utiliser à la place des anticorps?
◦Un gène non-endogènequi est exprimé et contrôlé par un promoteur
Gène rapporteur peut exprime par son promoteur propre ou insert a coté d’une promoteur endogène
◦Possibilité d’examiner l’expression spatialeet temporaled’un gène en mesurant le rapporteur
Donne un ex de gène rapporteur
LacZ a été mis à côté de Satb2 donc Satb2 est pu exprimé et LacZ est exprimé partout ou Satb2 aurait été exprimé
Qu’est-ce que la photoactivation des prot? et la photoconversion?
Rapporteur qui devient fluorescent après excitation avec un laser
Des protéines sont photoactivéesdans une zone restreinte (spatialement sélective)
Rapporteur qui peut changer son émission aprèsconversion avec un laser Vert -> rouge
Pourquoi faire la visualisation des circuits?
Un neurone ne fonctionne pas isolément
C’est important de connaître les cellules spécifiques du cerveau qui fournissent «l‘input» synaptique à un neurone d’intérêt, ainsi que les cellules spécifiques auxquelles le neurone se connecte.
Comment étudier les circuits
Les traceurs antérogrades et rétrogrades
Traceur neuronal:
◦Sonde chimique (ou génétique) qui marque les voies d’axones pour illuminer la connectivité dans le système nerveux
◦Décrit par la direction qu’il traverse dans un neurone
Quelques traceurs circulent dans les deux directions
D’autres circulent seulement en direction antérograde ou rétrograde
Peuvent être fluorescents ou chromogéniques
Quels sont 4 pts sur les traceurs?
Le traceur doit être injecté dans un animal vivant
Il faut attendre (1 a 7 jours) avant fixation et préparation pour les analyses
Traceur antérograde:
Devrait être dans le soma et les terminaisons pré-synaptiques des neurones injectés
Indique les zones vers lesquelles ces neurones projettent
Traceur rétrograde:
Devrait être dans le soma des neurones qui projettent à partir de site d’injection
Qu’est-ce qu’un traceur trans syn? Donne un exemple
Peuvent traverser des synapses et marquer plusieurs neurones dans un
circuit
◦Acides aminés radioactifs (3H-proline, 3H-leucine) mis dans l’environnement local duneurone primaire
◦Quelques acides aminés sont absorbés par des transporteurs
◦Dans la cellule, ces acides aminés sont incorporés dans des protéines
◦Certains traversent l’axone et sont secrétés àla terminaison synaptique et reçus par le neurone de deuxième-ordre
◦Peut être répété pour marquer un neurone trois-ordre
◦Détection par autoradiographie
Comment fctionne un traceur trans syn rétrograde avec vecteurs viraux? (un avantage et 2 désavantages et 2 ex)
Auto-amplification Marquage progressif des neurones dans un circuit quand ils deviennent infectés Pseudorabiesvirus Herpes simplex virus Avantage ◦Auto-amplification Désavantage ◦Peut tuer les neurones ◦Infection généralisée chez les animaux ◦Plus la durée d’infection est longue= plus le marquage est beau-mais les neurones primaires/ secondaires peuvent mourir
Quels sont 2 ex de types de traceurs trans syn?
Lectinesdes plantes
◦protéines avec de très hautes affinités pour des sucres spécifiques (ie. Glycoprotéines)
◦Wheatgermagglutinin(WGA)
Des virus
◦Pseudorabiesvirus
◦Herpes simples virus
◦(désavantage: si la durée de l’infection est longue, la probabilité que les neurones de première et deuxième ordres meurent, est accrue)
