Cours 8: Stratégies pour introduire un gène dans des cellules in vitro et in vivo Flashcards
Pourquoi vouloir introduire un gène dans une cellule? (3)
1- Produire une souris transgénique afin d’étudier la fonction d’un gène
2- Étudier les conséquences d’une mutation d’un gène sur le fonctionnement d’une cellule
3- Examiner comment un gène contrôle l’expression d’autres gènes
Quelles sont les Trois catégories de stratégies sont utilisées pour
introduire l’ADN d’un gène dans une cellule et la différence entre transfection et transduction?
1- force physique: ex. billes d’or
2- produits chimiques: liposomes
3- vecteurs viraux
- Transfection fait référence à une méthode non-virale pour introduire de l’ADN dans une cellule.
- Transduction implique que l’ADN est introduit par un vecteur viral. Les virus s’attachent à la cellule pour injecter l’ADN.
Les stratégies d’intro d’ADN dans une cellule ce distinguent par quoi (3) et quels sont les 3 Facteurs qui déterminent la sélection de la stratégie pour introduire l’ADN dans une cellule?
Chacune des stratégies se distingue par:
1- le nombre de cellules qui prendront l’ADN
2- le niveau d’expression du gène
3- l’expression dans le temps
Facteurs qui déterminent la sélection de la stratégie pour introduire l’ADN dans une cellule:
1- l’environnement cellulaire
2- type cellulaire
3-le but de l’expérience
Comment se fait l’introduction de l’ADN par force physique (3)? Quelles sont les 3 méthodes?
- Il s’agit de faire pénétrer l’ADN à travers la membrane cellulaire par
l’utilisation d’une force physique - Ces méthodes sont très efficaces et peuvent être utilisées pour toutes sortes de types cellulaires
- Cependant, elles peuvent conduire à des dommages de l’intégrité de la membrane cellulaire, traumatiser les cellules et ultimement conduire à la mort cellulaire.
Trois méthodes sont présentement utilisées dans les laboratoires:
1- microinjection
2- électroporation
3- biolistique
Qu’est-ce que la microinjection? (7)
-micro-injection d’ADN en utilisant
une aiguille de verre: très petite aiguille afin de ne pas endommager la membrane cellulaire
-la cellule incorpore l’ADN dans son
génome
-Équipement requis: un microscope, micromanipulateurs afin de placer de façon précise l’aiguille à la surface cellulaire.
Une seule cellule est injectée à la fois
-Cette méthode demande beaucoup de dextérité manuelle et donc n’est pas utilisée de façon routinière par un grand nombre de chercheurs.
-Méthode utilisée pour produire des souris transgéniques: injection d’ADN dans l’oeuf fécondé de souris: ADN incorporé de façon aléatoire dans le génome
-La micro-injection est rarement utilisée pour introduire de l’ADN dans les neurones à cause de leur petite taille et de leur fragilité: très difficiles à micro-injecter
Qu’est-ce que l’électroporation? (8)
- L’application d’un champs électrique aux cellules induit la formation de pores au niveau de la membrane cellulaire. Ces pores permettent à l’ADN de rentrer dans la cellule
- L’ADN qui est chargé négativement va être repoussé de la cathode vers l’anode dans le champs électrique
- Quand le champs électrique est enlevé, les pores se ferment et donc l’ADN demeure à l’intérieur de la cellule.
- Cette méthode peut être utilisée pour introduire de l’ADN in vitro et in vivo: neurones dissociés, des tranches de cerveau ou embryons.
- L’électroporation est utile pour introduire de l’ADN dans les neurones situés dans des régions qui sont adjacentes aux ventricules. La solution qui contient l’ADN est injectée dans les ventricules.
- La localisation de l’introduction de l’ADN peut être contrôlée par la position des électrodes
- La période de l’introduction de l’ADN peut également être contrôlée. Ex. l’expression peut être dirigée dans des couches spécifiques du cortex cérébral en faisant l’électroporation pendant une période embryonnaire spécifique
- Avantages de l’électroporation: peut transfecter plusieurs types cellulaires in vivo et in vitro. Possible de varier le niveau d’expression du gène en variant la force et le pattern du champs électrique
Comment se fait l’électroporation in utero? (5)
1- l’embryon est sorti de la mère
2- l’ADN est injecté dans les ventricules de l’embryon
3- En utilisant des électrodes en forme de palette: l’ADN est introduit dans les cellules par un champs électrique qui dirige l’ADN chargé négativement vers l’anode
4- l’embryon est replacé dans la mère
5- Les neurones des embryons qui vont naître exprimeront le gène introduit par électroporation
Qu’est-ce que la biolistique? (12)
- Le mot provient de balistique biologique: transfert d’un gène par particules en utilisant un fusil à gène (gene gun)
- Produire un mélange de particules de métaux lourds (tungsten ou or) et d’ADN
- Les particules de métaux lourds se lient à l’ADN qui est chargé négativement
- Les particules/ADN sont chargées sur une balle en plastique
- Un gaz pressurisé comme hélium est utilisé pour produire la force qui fait bouger la balle
- La pression du gaz augmente jusqu’à ce qu’elle rupture le disque et ainsi la pression libérée va propulser la balle le long du conduit du fusil à gène
- La balle de plastique est retenue à l’intérieur du conduit par un filtre alors que les particules qui sont liées à l’ADN sont éjectées à travers le filtre.
- Les billes d’or pénètrent la membrane cellulaire et ainsi elles introduisent l’ADN dans la cellule.
- Les cellules transfectées sont souvent dispersées. Ceci peut être un avantage lorsque nous voulons examiner la morphologie d’un neurone isolé suite à traitement.
- Cette approche peut permettre d’introduire de l’ADN dans une
structure ayant une certaine épaisseur comme une tranche de cerveau - Cette technique ne permet pas de transfecter des cellules in vivo
(exception foie et cellules de la peau) - L’inconvénient majeur de cette technique est qu’elle peut causer des dommages importants aux cellules—optimisation requise
Comment se fait l’Introduction de l’ADN par une méthode chimique? (7)
- Utilisation d’un produit chimique pour faire rentrer l’ADN dans les cellules
- L’ADN chargé négativement peut former un macro-complexe avec un produit chimique chargé positivement
- Ces macro-complexes se fixent à la surface des cellules ce qui va promouvoir leur endocytose ou fusion avec la membrane
- Ces méthodes sont les plus couramment utilisées dans les laboratoires de recherche: très efficaces (haut pourcentage de cellules transfectées) et très
simples à utiliser. - Inefficaces in vivo et donc elles sont principalement utilisées en culture cellulaire
- L’expression du gène est transitoire (peut durer quelques jours). Ceci dépend du type cellulaire.
- Les produits chimiques les plus utilisés sont: phosphate de calcium et lipides de transfection
Comment se fait la transfection par lipides? (8)
- Lipofection signifie transfection en utilisant des complexes de lipides pour introduire l’ADN dans les cellules
- Les membranes des cellules sont composées d’une couche bilipidique avec une surface hydrophobique du côté cytoplasmique et hydrophilique du côté extracellulaire
- La technologie de lipofection utilise des structures vésiculaires nommées liposomes qui ont la même composition que la membrane cellulaire
- Un liposome se forme autour de l’ADN
- Le liposome peut être endocyté dépendamment du type de liposome et du type cellulaire ou directement se fusionner avec la membrane cellulaire pour libérer l’ADN dans la cellule.
- L’avantage de la lipofection est que cette technique fonctionne avec un très grand nombre de cellules incluant les neurones
- Des réactifs sont vendus par plusieurs compagnies—transfection se fait en moins de 30 minutes et l’expression de gène débute quelques heures après la transfection.
- Comme la méthode phosphate de calcium, la lipofection est exclusivement utilisée en culture
Comment se fait l’Introduction d’un gène en utilisant un vecteur viral? (10)
- Un virus s’attache à une cellule dans le but d’y injecter son matériel génétique. Ce matériel code pour des protéines nécessaires à la production du virus—les cellules infectées deviennent des usines à produire des virus.
- Les virus utilisés en laboratoire ont été modifiés et donc ils ne peuvent plus se multiplier tout seul dans la cellule
- Une région codante du virus est remplacée par le gène d’intérêt.
- Ce processus d’utiliser un vecteur viral qui ne peut pas se multiplier pour introduire un ADN dans une cellule se nomme transduction
- Les infections virales sont robustes, très efficaces et peuvent conduire à une expression à long terme.
- Les virus sont utilisés pour l’expression de gènes dans des cellules en culture, tranches de cerveau, des explants de tissu et dans le cerveau in vivo.
- Ils sont l’outil de choix pour l’expression de gènes dans le cerveau d’animaux
- Ils ont des inconvénients et des limites:
- Les cellules infectées peuvent commencer à exprimer le gène plusieurs jours (7 à 14) après l’injection (pas expression immédiate du gène)
- La taille du vecteur viral limite la taille de l’ADN qui peut y être inséré.
- Problème de biosécurité—l’expérimentateur doit faire attention pour ne pas s’infecter.
- Il existe plusieurs types de vecteurs viraux: ils varient en fonction de leur efficacité à infecter les cellules, niveau d’expression, la période d’expression, le temps où commence l’expression, la toxicité cellulaire et la préférence de la cellule hôte.
Comment se fait la production de virus? (7)
- La technologie de recombinaison homologue est utilisée pour construire un virus qui va contenir le gène d’intérêt.
- Insérer le gène d’intérêt dans un vecteur (vecteur navette) qui contient les séquences nécessaires pour son incorporation dans une particule virale
- Co-transfection du vecteur navette avec le vecteur viral qui contient les séquences d’ADN qui codent pour les protéines virales: produit un virus qui ne peut pas se multiplier mais qui est fonctionnel et infectieux.
- La co-transfection est effectuée dans les cellules HEK 293T qui prolifèrent rapidement, se transfectent facilement et peuvent produire une grande quantité de virus.
- Un à deux jours après la transfection, les cellules produisent plusieurs particules virales et les libèrent dans le milieu extracellulaire
- La dernière étape de production de virus est de prélever le milieu et le centrifuger pour sédimenter les particules virales
- Le culot est resuspendu dans un tampon pour usage immédiat ou congelé pour usage ultérieur
Qu’est-ce que l’adénovirus? (4)
- Adénovirus peut infecter les cellules en division et les cellules postmitotiques comme les neurones
- Il peut contenir un ADN de 7.5 à 30 kb
- L’ADN n’est pas intégré au génome—expression transitoire qui peut durer des semaines ou des mois
- très utile pour une expression transitoire dans les neurones—mais peut causer une réponse inflammatoire et la mort cellulaire
Qu’est-ce que un virus adéno associé? (7)
- AAV est un virus qui est naturellement déficient pour se multiplier. Il a donc besoin d’un virus helper pour se multiplier—donc plus sécuritaire que les autres virus
- Il peut infecter les cellules en division et les cellules post-mitotiques comme les neurones
- Contrairement à l’adénovirus, il peut s’intégrer dans le génome ce qui permet une expression à long terme.
- Il est moins toxique pour les neurones que le virus adénovirus
- Sa production est très laborieuse
- Il peut contenir des ADN d’environ 5 kb
- besoin de 3 ADN pur faire AAV: gène intérêt, gènes viraux et herlper pcq AAV peut pas se multiplier
Utilise ADN viral prod pour transfection
Qu’est-ce que le lentivirus? (6)
- Ce virus appartient à la famille de virus qui se nomment retrovirus qui possèdent un génome d’ARN plutôt que d’ADN
- Afin de générer des produits de gènes fonctionnels, le virus possède l’enzyme transcriptase inverse qui produit l’ADN complémentaire (ADNc) d’un ARN
- Quand une cellule endocytose un lentivirus, l’ARN est libéré et la transcriptase inverse produit l’ADNc. L’ADNc migre au noyau où il est intégré dans le génome de l’hôte– expression à long-terme.
- le lentivirus est capable d’infecter les cellules mitotiques et postmitotiques
–donc très utilisé en neurosciences - Lentivirus peut contenir un ADN de 8 kb
- vecteur navette avec gène intérêt, vecteur du virus, vecteur avec enveloppe de prot,