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Méthodes expérimentales > Cours 7 > Flashcards

Cours 7 Flashcards

1
Q

Pourquoi les humains sont pas des bons sujets expérimentaux? (5)

A 
• Ils sont génétiquement hétérogènes.
• Il y a des différences
environnementales
• La reproduction est lente, peu de
progéniture
• Ils vivent trop longtemps
• Ils sont réticents à donner des tissus
ou à être injectés avec des toxines
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2
Q

Quelles sont les 8 caractéristiques communes des org modèles?

A
  • Croissance et développement rapides
  • Petite taille chez l’adulte et/ou facilité de manipulation
  • Anatomie relativement simple
  • Facilité de production (aménagements, coûts des opérations, etc.)
  • Manipulable génétiquement (génétique directe et réverse simples)
  • Outils de génétique moléculaire disponibles (e.g. transgénèse)
  • Génome séquencé et annoté
  • Multiples ressources (banques de données, collection de mutants, etc.)
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3
Q

Quels sont les 7 orgs modèles en neurobio?

A 
Invertébrés
Caenorhabditis elegans (nématode)
Drosophila melanogaster (mouche à fruit)
Vertébrés
Xenopus laevis (xénope)
Rattus norvegicus (rat)
Danio rerio (poisson zèbre)
Mus musculus (souris domestique)
Macaca mulatta (macaques rhésus)
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4
Q

Décrit le nématode

A

petit vers, existe en 2 formes: hermaphrodite (self fertilising) et mâle mais est juste 1/1000
Le mâle est utile pour faire les croisements génétiques pour garder les mutations (souches de vers avec +ieurs mutations)

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5
Q

Quelles sont 3 technologies utilisées pour les modèles invertébrés?

A

Les incubateurs 15, 20 and 25℃
Système de micro-injection
Stéréoscope fluorescent

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6
Q

Quels sont 6 avantages qu C. elegans?

A

INVARIANCE ANATOMIQUE, PETIT NOMBRE DE CELLULES : permet
l’identification de toutes les cellules de l’animal
TRANSPARENCE, SIMPLICITÉ, VITESSE et INVARIANCE DU
DÉVELOPPEMENT : permet la description du LIGNAGE CELLULAIRE
COMPLET : séries reproductibles des divisions cellulaires par lesquelles un oeuf fertilisé produit un adulte, marqueur à haute résolution du sort cellulaire
SYSTÈME NERVEUX entièrement reconstruit par sections de ME
GÉNÉTIQUE : petite taille, développement rapide, reproduction par autofertilisation et croisement facultatif pour faciliter les analyses génétiques
ANALYSE MOLÉCULAIRE : génome séquencé et bien aligné en cartes
génétiques, permet un progrès rapide des analyses moléculaires génétiques
On peut les congeler et ils sont vivants quand on les décongèle

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7
Q

Décrit le lignage cellulaire embryonnaire de C. elegans

A

Toutes les divisions qui servent à faire le vers sont tjrs les mêmes chez chaque vers, c’est invariant, c’est stable donc est un bon syst donc on peut facilement voir des mutants
Ya des patterns d spécifiques pour les diff cell ex y’en a un que son destin est la mort donc a permis de trouver quels gènes sont nécessaires pur la mort cell (ced-3 et caspase-9 = gène pour apoptose)

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8
Q

Qu’est-ce qu’un promoteur?

A

formé de séquences d’ADN spécifiques reconnues par des facteurs de transcription,qui sont recrutés, avec l’ARN polymérase, sur le site pour initier la transcription.
bcp de gènes sont très conservés dans bcp d’sp mais les promoteurs neu sont pas bien conservés donc il faut trouver des promoteurs pour presque chaque sp diff

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9
Q

Qu’est-ce qu’un amplificateur?

A

ce sont des séquences d’ADN régulatrices qui, lorsqu’elles sont liées par des protéines spécifiques,
appelées activateurs, améliorent la transcription du gène associé
aug la trans, permet de contrôler le niveau d’expression

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10
Q

Qu’est-ce qu’un inactivateur?

A

c’est une séquence d’ADN qui

peut se lier à des facteurs de régulation de la transcription, appelés répresseurs.

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11
Q

Qu’est-ce qu’un transgène et un animal transgénique? Comment on les fait?

A
  • Tout gène exprimé dans un animal qui ne porte pas normalement ce gène est appelé un transgène, et tout animal qui porte cet ADN étranger est appelé un organisme transgénique.
  • Les scientifiques peuvent injecter ces transgènes dans des embryons pour créer des lignées transgéniques d’animaux qui passeront le transgène à leur descendance. Sinon, ces transgènes peuvent aussi être introduits directement dans des cellules ou des régions du cerveau.
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12
Q

Comment on fait une mouche transgénique?

A

• Le processus de fabrication d’une mouche transgénique utilise des
segments d’ADN spécialisés, endogènes appelés transposons
qui peuvent se déplacer d’une position à l’autre du génome.
• Ces séquences génétiques mobiles ont une sélectivité modeste de leur site cible dans le génome et peuvent donc s’insérer en des emplacements génomiques aléatoires.
• Dans la transposition, une enzyme appelée transposase agit sur
des séquences d’ADN spécifiques à la fin d’un transposon, en le
déconnectant d’abord de son ADN flanquant, puis en l’insérant dans un nouveau site d’ADN cible.

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13
Q

Comment se fait l’Injection de construction transgénique dans les mouches?

A
  • Pour faire des mouches transgéniques, un chercheur va faire une micro-injection d’ADN transgénique dans le postérieur d’un embryon de Drosophile.
  • Le chercheur injecte la construction transgénique dans un jeune embryon de Drosophile avec également un autre plasmide séparé contenant le gène codant pour la transposase
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14
Q

Comment on fait des vers transgéniques?

A

les vers ont un gonade; un long tube avec bcp de noyaux et injecte dans une partie ou ya pas de memb et noyaux vont vers là et gardent l’ADN comme un chromom extra (extra chromosomal array) mais le nbre de progéniteurs qui gardent le chrom est très instable
Un transgène est injecté dans la gonade d’un hermaphrodite
jeune adulte au moment où les embryons se divisent.

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15
Q

Vrai ou faux? le niveau d’expression est stable?

A

Le niveau d’expression est aléatoire et un transgénique est variablesi on aime notre transgénique, on doit faire un transgénique stable, on doit faire intégrer le chrom dans le génome

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16
Q

Comment on fait des poissons zèbres transgéniques?

A

injecte ADN avec un marqueur dans embryos de poisson zèbre et regarde les larves + tard

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17
Q

Comment on peut être sure que cette mutation est la cause d’un phénotype?

A

on fait un rescue test, injecte le gène dans le vers avec le gène muté pour voir si bon phénotype revient mais risque de fuck up l’injection donc on met un marqueur pour voir si, vue que ce gène est pour la peau, fluo sera dans la peau et si la forme revient normale, on sait que ce gène muté était la cause de la mutation

18
Q

Comment contrôler quand et où un gène est exprimé?

A

facteur de trans devient actif avec le choc termique et fait trans des heat shock proteins
peut prendre promoteur du gène du choc thermique et l’utiliser pour causer expression d’un gène spécifique juste quand on cause choc thermique
On peut aussi faire l’expression des gènes par le stress; + stress, ya bcp d’expression de la prot, le promoteur rép au stress, pas de stress -> prot est pas exprimé, on contrôle quand le gène est exprimé

19
Q

Comment on utilise des transgènes pour contrôler l’activité neuronale?

A

Optogénétique avec channelrhodopsin / halorhodopsin
activation avec lumière bleue -> dépola
activation avec lumière jaune -> hyperpola

20
Q

Qu’est-ce que l’activation inductible de l’activité neuronale?

A

Channelrhodopsin-2: activation des neurones mécanosensoriels
mec-4 code pour un canal Na+, qui est exprimé dans les neurones mécanosensoriels. Ainsi, le promoteur mec-4 peut être utilisé pour exprimer des gènes spécifiquement dans les neurones mécanosensoriels.
Activer les neurones mécanosensoriels avec la lumière provoque des changements de
direction des animaux

21
Q

Qu’est-ce que l’inhibition inductible de l’activité neuronale?

A

Halorhodopsin: inhibition des neurones moteurs
unc-17 code pour une vésicule synaptique de transport de l’acétylcholine, ainsi le promoteur unc-17 peut être utilisé pour exprimer des gènes dans les neurones moteurs
Inhiber les neurones moteurs avec la lumière provoque la paralysie des animaux.

22
Q

Comment on observe l’activité neuronale?

A

Indicateurs transgéniques de Ca2+
e.g. GcaMP = fusion of green fluorescence protein (GFP), M13, and calmodulin (CaM)
CaM et GFP non lié à Ca2+ -> La structure permet la protonation
Faible absorbance de la lumière,
Pas de fluorescence
CaM et GFP lié à Ca2+ -> Changement conformationnel de CaM, Changement structurel
Déprotonation rapide de GFP,
Fluorescence lumineuse
Activité neuronale → fluorescence

23
Q

Décrit le circuit neuronal de la mécanosensibilité chez C. elegans

A 
Quand touche vers, sommation du circuit fait en sorte que vers change de direction ou pas
mec-4 encode un canal sodique, et
s'exprime dans les neurones
récepteurs tactiles (neurones
sensoriels).
24
Q

Décrit la Dynamique du calcium dans les interneurones avant, pendant et après la stimulation des neurones mécanosensoriels

A

mec-4: est dans neurone mécanosensoriel, lumière active le neurone
rig-3: est dans interneurone, marqueur de Ca2+
quand allume lumière, vers change de direction et on peut regarder activité calcique
Lors de changement de direction, GCaMP aug bcp (activité neuronale aug bcp)
GCaMP est un marqueur de l’activité neuronale

25
Q

Quelles sont les 6 limites de l’ontogénétique?

A
  • Compréhension incomplète de la fonction cérébrale
  • Accès génétique sélectif et complet à des sousensembles de neurones
  • Contrôle optique de cellules individuelles dans une population
  • Systèmes de livraison de lumière
  • Expression d’Opsin - stabilité, interférence avec le métabolisme cellulaire
  • Synchronisation non physiologique du réseau neuronal
26
Q

Pourquoi utiliser des gènes pour l’ablation de neurones?

A
  • Les études de lésions pour enquêter sur la nécessité d’une région du cerveau ou d’un groupe spécifique de neurones pour une fonction spécifique du comportement ou du cerveau ou pour modéliser une maladie humaine impliquant la mort de sous-types neuronaux spécifiques
  • La technologie transgénique permet de cibler les lésions sur des sous-ensembles spécifiques de neurones, définis génétiquement.
  • Une des techniques est l’expression de protéines toxiques par exemple, l’ataxine, le récepteur de la toxine diphtérique ou les caspases.
27
Q

Comment on utilise des caspases pour l’ablation des neurones?

A

On tue un tissu spécifique quand on veut
mec-4: expression dans les neurones mécanosensoriels
hsp-16: expression dans toutes les cellules à des T° élevées
La caspase a un prodomaine (prot qui est là pour garder la prot inactive) quand on le clive, la prot devient actif, cette caspase a 2 morceaux (nécessaires pour activité), peut séparer les 2 domaines nécessaires pour faire 2 transgènes avec un linker, quand on fait ça, la prot dans le transgénique sera active
à 15°, on voit bien le neurone mécanosensoriel mas à 34° il est pu là pcq avec le heat shock active la caspase

28
Q

Comment inhiber l’expression d’un gène?

A

Perturbation de la fonction endogène du gène: ARNi
• L’interférence ARN (ARNi) est un processus pour faire taire l’expression des gènes par des mécanismes cellulaires endogènes qui dégradent l’ARNm.
• Les cellules utilisent naturellement l’ARNi pour réguler l’expression génique normale, ainsi que pour dégrader les transcrits d’ARNm de virus étrangers.
• Les chercheurs utilisent maintenant ce processus naturel pour réduire sélectivement l’expression de gènes et pour dégrader l’ARNm de gènes d’intérêt

29
Q

Comment Dicer fctionne?

A 
“Dicer” est une enzyme qui clive
l'ARN double brin en petits
fragments de duplex, environ
23pb en taille.
Ces fragments sont appelés
“small interfering RNA (siRNA)”.
Le complexe siRNA-Dicer
recrute d'autres protéines pour
former un un “RNA-induced
silencing complex (RISC)” qui
conduit à la dégradation de
l'ARNm avant qu'il ne soit traduit
30
Q

Qu’est-ce qu’un syst transgénique binaire?

A

• Les systèmes d’expression binaires utilisent plusieurs constructions pour affiner l’expression spatiale et temporelle d’un transgène.
• Cela se fait par la création de deux lignées différentes d’animaux
transgéniques, chaque lignée exprimant l’une des constructions
nécessaires. Puis l’accouplement des animaux va produire des
descendants qui expriment les deux constructions.
• Le principal avantage de cette approche est qu’ils peuvent fournir un contrôle sur le moment et le lieu de l’expression du transgène.
• Un autre avantage est la possibilité de mélanger et assortir les combinaisons de transgènes: gain de temps et d’efforts à faire de
nouvelles constructions transgéniques.

31
Q

Qu’est-ce que le syst Gal/UAS?

A

Dans la droso
Dans une construction, un
promoteur spécifique entraîne
l’expression du gène codant pour Gal4, un facteur de transcription normalement exprimé dans la levure.
Dans une seconde construction, un transgène d’intérêt est régulé par une séquence de promoteur
appelé “upstream activation
sequence” (UAS).
• La protéine GAL4 se lie à la séquence UAS et permet d’exprimer le transgène.
• Ainsi, le transgène ne s’exprime que les cellules définies par le promoteur régulant GAL4
Permet d’exprimer le gène d’intérêt dans diff tissus, dans des cell spécifiques
Pas besoin de changer le promoteur du gène voulu, on a yek a changer le promoteur avant GAL

32
Q

Qu’est-ce que le syst Gal/UAS ARNi?

A

Crée ARN db avec inverse complémentaire du gène
Fait ARNi dans tissu spécifique quand on veut
Bon outil pour dim expression d’un gène dans un tissu spécifique

33
Q

Qu’est-ce que la génétique classique pour découvrir les gènes neuronaux?

A
  • La génétique inverse (ARNi) est une approche pour modifier un gène et chercher un phénotype.
  • La génétique classique commence avec des animaux normaux, qui sont traités avec un agent mutagène.
  • La descendance des parents ayant subi une mutagenèse est examinée pour les phénotypes d’intérêt.
  • Le gène mutant est alors identifié par des techniques de biologie génétique, génomique et moléculaire.
34
Q

Qu’est-ce que l’approche d’édition du génome CRISPR-Cas9

A

Des jeunes hermaphrodites adultes sont injectés avec le mélange d’ADN contenant CRISPR-Cas9.
Un DSB généré par Cas9 est réparé via le NHEJ propice aux
erreurs ou HR sans erreur.
La boîte jaune représente l’insertion de petits nucléotides et
la boîte verte représente l’insertion de la marque GFP.

35
Q

Qu’est-ce que l’épidémologie de la Sclérose Latérale Amyotrophique?

A

• Affecte 1-3 individus sur 100,000 (1/1000 morts)
• Âge moyen du diagnostic : 55 ans
• Espérance de vie :
• 50% vivent 2-3 ans après le diagnostic
• 25% vivent 5 ans ou plus
• 10% vivent 10 ans ou plus
• Perte progressive et sélective des
motoneurones dans le cortex moteur, le tronc cérébral et la moëlle épinière.
• Mort par dénervation des muscles respiratoires
Énormément de gènes sont impliqués dans SLA, c’est normalement familial mais sporadique

36
Q

Qu’est-ce que TDP-43?

A

bcp de mutations dans cette prot
RNA binding prot, fait bcp de fctions, on sait pas laquelle de ses fctions est impliqué dans la maladie
c’est autosomique dominant, est + facile à recréer dans modèle animal
Prend gène malade humain et met dans vers

37
Q

TDP-43 est exprimé ou dans C elegans?

A 
Dans les MN
Neurones GABAergiques (26/302 neurones au total)
38
Q

Qu’est-ce qui arrive aux transgéniques de TDP-43?

A

Les transgéniques TDP-43 ont des
problèmes de mobilité
Les mutations de TDP-43 provoquent des anomalies de la mobilité conduisant à la paralysie à l’âge adulte

39
Q

Pourquoi la paralysie vient juste à l’âge adulte?

A

La mutation de TDP-43 change confo de la prot et agrégation donc cause maladies neurodégénératives
Patient peut être correct pour +ieurs années mais après trop accumulation mauvaise prot –> mort cell mais se voit très vite chez vers

40
Q

La culture liquide cause quoi pour les mutants de TDP-43?

A

Vers nage donc est super actif donc jction neuromuscu sont très actifs
Phénotype de paralysé qui normalement prend 10 jrs dans plat de pétrit prend 6 h, montre neurodégénérescence tôt, phénotype fort
Peut faire criblage des petites molé dans la même journée in vivo

Méthodes expérimentales (13 decks)

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