Cours 11: Manipulation des gènes endogènes

Question 1

Quels sont les buts de la modélisation animale? (4)

Answer 1

Le système nerveux est complexe, composé de types cellulaires diversifiés et de réseaux neuronaux finement connectés et régulés.
La modélisation animale et les approches génétiques aident à:
1. Libeller sélectivement des sous-populations données pour en étudier le développement et la fonction au sein des circuits
2. Étudier l’effet de la perte ou du gain d’un gène donné sur les circuits neuronaux
3. Préciser l’impact de nouvelles mutations sur les circuits
4. Mieux comprendre les voies moléculaires impliquées dans les fonctions normales et les pathologies du SNC

Question 2

Quel est le but et les méthodes du marquage génétique de populations neuronales ciblées?

Answer 2

But: Charactériser les propriétés physiologiques, la connectivité et les propriétés biochimiques et
génétiques d’une sous-population de neurones au sein de circuits complexes
Méthodes: Transgènes, knock-in

Question 3

Qu’est-ce qu’un transgène?

Answer 3

Permet d’exprimer une construction exogène
Crée structure génétique en utilisant bouts d’ADN choisis pour avoir effet qu’on fait et on utilise les promoteurs sécifiques
Utilise ex promoteur qui prod GABA pour exprimer des choses dans les cell GABAergiques
S’intègre pas dans le génome de l’org, on crée la construction, utilise le promoteur qu’on veut
Transgène mis dans une souris ou dans un vecteur

Question 4

Qu’est-ce qu’un KI?

Answer 4

Modification d’un gène endogène par recombinaison homologue
Construction génétique avec la cassette qu’on veut exprimer et on a 2 bras d’homologie; prend région ou on veut exprimer KI (utilise site de gène qui prod GABA), remplace iune partie du gène par une casette, 1500 pb de chaque côté pour être très précis, quand on insert, les bras d’homologie consnaissent la s fait recombinaison homologue
Utilise le promoteur endogène

Question 5

Comment se fait la création d’un transgène?

Answer 5

Choix du promoteur:
• Séquence d’ADN permettant la
liaison de la polymérase ARN initiant la transcription d’un gène.
• Pour la création d’un transgène, on choisit un promoteur d’un gène
exprimé de façon ubiquitaire
(partout) ou sélectivement dans
une population cellulaire d’intérêt

Question 6

Comment se fait le Clonage d’un transgène?

Answer 6

1. Sélectionner un plasmide exprimant le promoteur voulu (A).
2. Sélectionner un 2e plasmide contenant une cassette d’expression désirée (ex: EGFP, Cre) (B).
3. Sous-cloner (insérer) le promoteur du plasmide (A) en avant de la cassette d’expression du 2e plasmide (B)

Question 7

Quelles sont les 8 étapes de la génération de souris transgéniques?

Answer 7

1. Construction du transgène – Sélection d’un promoteur spécifique – Clonage du cDNA choisi (EGFP, LacZ, etc)
   – Purification de l’ADN (électroélution)
2. Superovulation de femelles adultes FVB/N
3. Croisement avec mâle WT
4. Extraction des zygotes
5. Microinjection de l’ADN (2ng/ul) au pronucleus
6. Conservation: 370C, 5% CO2 ad transfert
7. Transfert des embryons: femelles pseudo-gestantes
8. Identification des bébés porteurs (fondateurs)

Question 8

Comment on fait l’identification des porteurs?

Answer 8

Southern
Effet positionnel: expression qui ne concorde pas toujours avec celle attendue pour le promoteur choisi
C’est possible que juste certains neurones ciblés avec le promoteur expriment le transgène dans les bonne cell
pour savoir lequelle porte le transgène, peut avoir +ieurs copies du même transgène qui s’ajoutent un après l’autre
Chaque fondateur est un peu diff, le transgène est pas à la même place pour chaque et pas le même nbre de copies donc chaque fondateur est unique, on choisit entre eux lequel a intégré le transgène de façon qui est le + utile pour notre étude

Question 9

Quelles sont les 3 utilités du marquage sélectif grâce aux animaux transgéniques?

Answer 9

1. Visualiser les cellules pour étudier leurs propriétés fonctionnelles (patch-clamp), leur distribution et leurs propriétés biochimiques (co-marquage en immunofluorescence, décompte cellulaires)
2. Extraire sélectivement des populations données (FACS) pour effectuer des études de profilage (génomique, ARN, protéique)
3. Visualiser des structures anatomiques cellulaires in vivo (ex: remodelage des épines dendritiques, synapses, etc…)

Question 10

Comment se fait la production d’un KI? (5 étapes)

Answer 10

Insertion d’une cassette après le codon d’initiation (remplacement d’un gène endogène; utilise promoteur endogène)
*Knock-in: insertion d’un nouveau gène au site d’un autre gène Knock-out: ablation d’exons d’un gène cible pour le rendre inactif
1. Production de l’allèle recombinante
2. Microinjection dans des cellules souches WT – Sélection des cellules ayant incorporé le KI (néomycine: sélection +, gangyclovir: sélection -)
3. Insertion des cellules souches dans un blastocyste dans la masse cellulaire interne
4. Transfert du blastocyste à une mère porteuse
5. Croisements successifs des bébés ad obtention d’un knockin uniforme
Bébés sont tous diff les uns des autres, on les croise ensemble et ils vont les avoir dans leurs gamètes et pourront le passer de génération en génération mais prend du t

Question 11

Comment se fait la vérification du génotype?

Answer 11

Southern ou PCR
Une fois l’intégration adéquate de la cassette confirmée par Southern blot, il faut vérifier l’expression de la cassette insérée (ex: par immunohistochimie: visualiser l’expression de l’EGFP dans les cellules attendues). - Habituellement, l’expression du KI est plus fiable que celle du transgène (i.e. pas d’effet positionnel), mais expression est parfois de niveau plus faible **Attention perte d’une copie du gène endogène

Question 12

Quels sont 3 usages d’un KI?

Answer 12

Marquage sélectif

• générer un knockout constitutif ou conditionnel
• insérer une mutation ponctuelle

Question 13

Comment se fait le « Fate-mapping à l’aide de l’approche Cre/LoxP»?

Answer 13

Marquage sélectif pour suivre l’évolution d’un type cellulaire
loxp = sites reconnu par Cre et enlève ce que ya entre les 2 (enlève le STOP) donc cell expriment EGFP
Cell qu’ont Cre pourront donc être vues en vert
On fait Cre loxp pour faire délétion
Cre est pas visible donc nécessite fluo pour voir
Peut exprimer vert avec un transgène dans une pop de neurones et utiliser Cre loxP et rouge dans une autre P pour pouvoir marquer 2 pop de neurones et voir comment elles interagissent entre elles

Question 14

Comment se fait la comparaison de différentes allèles reportrices?

Answer 14

Intensité de la fluorescence varie d’une lignée à l’autre.
Sélectionner un lignée stable, couramment utilisée
Possibilité de coupler un marquage Cre-LoxP rouge avec un marquage EGFP transgénique pour une autre population

Question 15

Qu’est-ce que CreER?

Answer 15

Précision temporelle (permet de marquer sélectivement des sous-
types neuronaux produits à un temps X)
CreER, la seule façon qu’il revient au noyau est avec la tamoxifen donc donne tamoxifen à l’âge ou on veut avoir expression de Cre
Peu donner tamoxifen à diff stades de grossesse ou voir aux diff étapes de dév les effets d’un gène
Au moment ou donne tamoxifen, c’est là que Cre a son action dans le noyau

Question 16

Comment on fait la Génération d’une souris knockout?

Answer 16

Production d’un knock-in qui permet de remplacer un gène d’intérêt
(souvent les premiers exons) par une cassette de sélection
Toutes les cell sont KO, toutes les cell qui l’expriment normalement sont KO
Si KO Shh, l’org est pas viable mais si on fait ça on peut pas étudier Shh + tard dans le dév donc on utilise la délétion conditionnelle

Question 17

Qu’est-ce que la délétion conditionnelle?

Answer 17

Cre-LoxP
Utile pour éviter mortalité précoce • Sélection d’une allèle exprimant la Cre (recombinase) sous le contrôle d’un promoteur sélectif aux cellules d’intérêt: structures ou populations ciblées
• Attention aux effets positionnels des tansgènes: toujours vérifier l’expression de votre Cre avec une allèle reportrice
• Si l’allèle Cre est un knock-in: attention car il y a perte d’une copie du gène au locus ciblé ce qui peut affecter le phénotype

Question 18

Comment se fait l’ablation de Sox6 (gène essentiel)? et ça permet quoi?

Answer 18

Gène d’intérêt, choisit exons crititiques
Croise avec souris qui exprime Cre et rapporteur pour qu’une souris ait toutes les allèles
1. Sélectif aux INs
2. Souris viables
3. Marquage des INs mutés
On peut suivent les cell pcq sont marquées et on sait qu’elles ont le gène d’intérêt de délété, cell sont marquées poru leur durée de vie donc même si cell sont disfctionnelle et morpho changée, on peut les suivre
Permet d’évaluer l’impact au niveau cellulaire et au niveau du fonctionnement global (épilepsie, comportement, etc…)

Question 19

Qu’est-ce que le CRISPR-Cas9 direct genome editing?

Answer 19

Méthode plus rapide car modification génique directe de l’embryon
L’approche peut générer des knockout (Non homologous End Joining)
Et/ou des knockin (Homology-Directed gene Repair)
KI pcq mod direct le génome mais est + nice pcq prend pas bcp de t
Génère guide qui peut reconnaitre s d’ADN qu’on veut cibler
Prend guide et génère Cas9 qui dès qui vot s guide va couper ADN et trou se referme par recombinaison (cause KO), à chaque ronde de Crispr on obtent qq KO
Ce qu’on veut faire c’est KI une mutation donnée pour voir effet d’une mutation ciblée, on fiat guide ARN et insert un template de réparation et de façon stochastique soit ADN répare ou insert le KI,
Méthode pas encore optimale (peut pas insérer grand chose)
Peut utiliser pour faire souris ou avec virus qu’on insère dans cerveau mais dans ce cas toutes les cell ont délétions un peu diff, approche est pas superbonne pour in vivo pcq on sait pas trop comment favoriser la répatation qu’on veut ou sinon on peut utiliser des cell souches, peut étudier impact d’une même mutation dans des cell qu’on le même bagage génétique et compare avec le ctrl; peut faire au niveau cell ou dans des animaux

Question 20

Quels sont les 3 Usages de la mutagénèse dirigée par CRISPR/Cas9?

Answer 20

1. Générer de knock-out (délétion, frameshift) de façon rapide et efficace
2. Générer des knock-in porteurs de mutations ciblées (humanisées)
   Besoin d’investiguer plusieurs fondateurs car l’efficacité du
   knock-in est faible (biais vers une réparation de l’ADN sans introduction du fragment homologue)
3. Corrections de défauts génétiques (ex: résection
   d’une duplication génique…)

Question 21

Qu’est-ce que la répression ciblée (knock-down)?

Answer 21

Dégradation de l’ARN avant la production d’une protéine
On peut utiliser directement des siRNA (culture, effet rapide, expression transitoire) ou créer un transgène exprimant un shRNA
sous le contrôle d’un promoteur spécifique (expression durable)
ARNdb -> dicer le clive en siARN -> attire RISC -> RISC attaque ARNm complémentaire au siARN -> RISC dégrade l’ARNm

Question 22

Qu’est-ce que le shARN?

Answer 22

• Choisir une séquence spécifique au gène d’intérêt (BLAST dans NCBI)
• shRNA contrôle (scramble): séquence sans homologie chez la souris
• Important de tester plusieurs shRNA : efficacité variable
• Vérifier la spécificité de l’effet avec un « rescue » shRNA-résistant

Question 23

Quelles sont les 3 raisons de faire de la surexpression?

Answer 23

1. Correction d’une perte de fonction (même gène ou gène en amont)
2. Étude de l’effet d’un gène à différentes étapes du développement
3. Modifier l’activité d’un circuit neuronal à différents moments

Question 24

Comment se fait l’Expression temporelle d’un transgène?

Answer 24

Permet de contrôler le moment de l’expression ou de l’arrêt d’expression du transgène
TetOFF: transgène tjrs actif jusqu’à donne Dox
TetON: transgène inactif jusqu’à t que donne Dox

Question 25

Quesl sont les 3 utilités et la limite des transgènes (promoteur spécifique)?

Answer 25

1. Vérifier l’expression d’un
gène X pré/post-natal 
2. Marquer une population cell.
3. Sur-exprimer un gène X
(gain de fonction) 

1. Expression non- spécifique ou
   trop sélective (effet positionnel)

Question 26

Quel est l’utilité et la limite de tet On/Off?

Answer 26

1. Exprimer un transgène à un moment précis

1. Expression selon le promoteur

Question 27

Quels sont les 2 utilités et la limite des KI?

Answer 27

1. Expression d’un marqueur au site endogène (LacZ; Cre…)
2. Insertion d’une mutation ciblée
3. Intensité de l’expression dépend du locus (parfois plus faible que transgène)

Question 28

Quel est l’utilité et les 2 limites du KO?

Answer 28

1. Perte de fonction du gène
2. Parfois létal
3. Toutes les cellules

Question 29

Quelles sont les 2 utilités et la limite du KO conditionnel?

Answer 29

1. Perte de fonction sélective dans une population donnée
2. Précision temporelle (Cre-ER)
3. Spécificité dépend de l’allèle Cre

Question 30

Quelles sont les 2 utilités et les 2 limites du KD?

Answer 30

1. Répression d’un gène avec une précision temporelle
2. Rapidité, flexibilité
3. Effet non-spécifiques
4. Toxicité?

Question 31

Quelle est l’utilité et la limite de CRISPR?

Answer 31

1. Génération de souris knock-
   out ou knock-in de façon plus rapide
2. Difficile de contrôler taux de recombinaison homologue (délétion plutôt que knockin)

Question 32

Quels sont 3 méthodes de transfert de plasmides?

Answer 32

Électroporation in utero
Transfection biolystique
Vecteur viral

Question 33

Qu’est-ce que l’électroporation in utero?

Answer 33

Permet de modifier des neurones embryonnaires. Injection intra-ventriculaire d’un plasmide, puis application d’une série de décharges (5 x 50mV) pour faire pénétrer l’ADN dans les cellules. L’ADN demeurera de façon épisomal et sera
transcrit de façon soutenue en fonction du promoteur choisi.
Peut fauire approche + mosaique, qq cell sont mutantes mais au moins les autres cell dans crcuit sont correct donc on sait si phéno vient de effet sur une cell ou sur circuit au complet

Question 34

Qu’est-ce que la transfection biolystique?

Answer 34

On couple l’ADN sur des billes d’or qui sont projetées à haute vitesse dans les cellules cibles (dissociées en culture ou en tranches organotypiques)
Modification unicellulaire (mosaïque)

Question 35

Pourquoi on utilise des vecteurs viraux? (6)

Answer 35

• L’utilisation de vecteurs viraux permet d’exprimer un transgène de façon soutenue, avec un contrôle temporel et spatial.
• L’utilisation d’un promoteur sélectif ou d’un virus Cre-dépendant permet de limiter l’expression à un type de cellules donné.
• Expression maximale: 14j
• Durée: 10-12 sem.
• Choisir le sérotype selon
l’organe/cellules ciblés
• AAV plus simples à produire que les rétrovirus mais capacité (taille) d’insert restreinte

Question 36

Quelle est l’utilité et les 2 limites de la transgénèse?

Answer 36

1. Expression soutenue durant le développement
2. Temps requis
3. Screening lignées

Question 37

Quelles sont les 3 utilités et la limite de l’électroporation in utero?

Answer 37

1. Expression à partir d’un moment précis du développement
2. Spécificité cellulaire et spatiale
3. Concentration élevée
4. Populations plus difficiles d’accès (interneurones, thalamus…)

Question 38

Quelle est l’utilité et la limite de l’électroporation in vitro?

Answer 38

1. Modifier cellules en culture ou tranches

1. In vitro

Question 39

Quelle est l’utilité et les 2 limites de la transfection biolystique?

Answer 39

1. Modification de neurones en mosaïque
2. Post-natale
3. Cellules isolées

Question 40

Quelles sont les 3 utilités et 3 limites du virus AAV?

Answer 40

1. Expression de protéines fluorescentes, GCAMP, opsines (ChR2)
2. Modification localisée temps et espace
3. Peut modifier des populations neuronales spécifiques (AAV Flex: Cre-dépendant)
4. Délai expression (2 semaines)
5. Durée limitée (semaines?)
6. Sérotype détermine efficacité d’expression dans des populations spécifiques

Question 41

Quelles sont les 2 utilités et les 2 limites du lentivirus?

Answer 41

1. Neurones en division
2. Expression robuste soutenue
3. Pathogène BSL2
4. Compliqués à produire