Cours 10: Microscopie

Question 1

Antonie van Leeuwenhoek a observé quoi avec son invention du premier microscope?

Answer 1

•Il a découvert les organismes unicellulaires: les protozoaires (ex. Paramecium), les bactéries et les spermatozoïdes.

Question 2

Zacharias Jansen a fait quoi?

Answer 2

• Janssen est crédité d’avoir inventé
le premier microscope composé
• Le terme «composé» se réfère à l’utilisation de deux ou plusieurs lentilles à l’unisson pour le grossissement d’un objet.

Question 3

Robert Hooke a fait quoi?

Answer 3

Microscope composé avec 2 lentilles et lumière permet meilleure résolution et un specimen holder
Ajd on a basically toutes les mêmes composantes mais c’est bcp + puissant

Question 4

Quels sont les principes essentiels de la microscopie?

Answer 4

Le grossissement et la résolution

Question 5

Qu’est-ce que le grossissement?

Answer 5

Il se réfère à combien l’échantillon apparaît plus grand par rapport à sa taille réelle ou combien de fois l’image a été grossie par le microscope
Le grossissement d’un objet n’améliore pas nécessairement la résolution de l’image

Question 6

Qu’est-ce que la résolution?

Answer 6

La résolution est la qualité ou la netteté de l’image. La résolution permet de séparer deux objets étroitement placés sur une image. Résolution: la plus petite distance entre deux points pouvant être distinguée par un microscope.

Question 7

Qu’est-ce qu’il faut faire pour avoir une bonne qualité d’image?

Answer 7

Pour avoir bonne qualité c’est un eq entre grossissement et résolution et on veut maximiser les 2

Question 8

La résolution dépend de quoi et quelle est la limite de la résolution?

Answer 8

• L’ouverture numérique (ON)
• La longueur d’onde de la lumière
Résolution est directement proportionnelle à lambda et inversement proportionnelle à l’ouverture numérique fois 2

La limite de résolution d’un système est basé sur la distance minimale a laquelle deux points peuvent être distingués individuellement.

Question 9

Qu’est-ce que lambda et comment lambda affecte la résolution?

Answer 9

• La longueur d’onde (λ ) est la distance sur laquelle la forme de l’onde de lumière se répète.
•Des longueurs d’onde plus courtes donnent une résolution plus élevée
+ grande f = + petite lambda et vice versa
Pour aug résolution on veut donc + grande f

Question 10

Qu’est-ce que le spectre visible?

Answer 10

Une représentation de l’ensemble des composantes monochromatiques de la lumière visible.
Le spectre visible ou spectre optique, peut aussi être appelé spectre lumineux, est la partie du spectre électromagnétique qui est visible pour l’oeil humain.

Question 11

Qu’est-ce que l’ouverture numérique et comment elle affecte la résolution et elle dépend de quoi?

Answer 11

• L’ouverture numérique (ON) d’un système optique est une mesure de la capacité de collecter de la lumière (p. ex. l’objectif du microscope qui recueille la lumière provenant de l’échantillon).
• Plus la ON est élevée, meilleure est la résolution d’un microscope
• L’ON d’un objectif dépend de:
-l’indice de réfraction (n) du milieu dans lequel l’objectif fonctionne
(ex.eau,huile,air).
- l’angle (𝛼) auquel la lumière pénètre l’objectif du microscope
• Un objectif avec une ON supérieure permettra de recueillir plus de rayons lumineux, conduisant à une meilleure puissance de résolution

Question 12

Quelles sont les 2 limitations de la microscopie et comment on peut augmenter la résolution (2)?

Answer 12

La résolution du microscope optique est limitée par la diffraction de la lumière:
• La longueur d’onde (dans le spectre visuel, la plus courte = ~400 nm)
Pour augmenter la résolution il faut:
● utiliser des longueurs d’ondes hors le spectrum de lumière visible (microscope électronique: faisceau de particules d’électrons)
● modifier le patron de diffraction de la lumière (ex. nouveaux microscopes de super résolution STED, etc.)

Question 13

Qu’est-ce qu’un microscope simple? (3)

Answer 13

● Refraction de la lumière dans un plan focal
● Magnification limitée
Une seule lentille participe au grossissement

Question 14

Qu’est-ce qu’un microscope composé et ses somposantes? (5)

Answer 14

• Le terme «composé» se réfère à l’utilisation de deux ou plusieurs lentilles à l’unisson pour agrandir un objet.
• La plupart des microscopes optiques utilisent au moins deux lentilles :
-lentille de l’objectif (proche a l’échantillon)
-lentille oculaire (proche de l’oeil; ramasse la lumière de l’échantillon et magnifie l’image)
•Amplification total: lentille de l’objective multipliée par lentille oculaire
•Le condenseur (condenser) focalise la lumière de la source sur l’échantillon
Les autres composants du
microscope permettent d’ajuster le
grossissement, le focus, l’intensité
de la lumière, et la position de
l’échantillon

Question 15

Qu’est-ce qu’un microscope optique et ses 4 types?

Answer 15

Un microscope optique est tout microscope qui utilise la lumière visible pour illuminer et créer une image de l’échantillon.
Il existe plusieurs modalités de microscopie optique:
● Microscopie en champ clair (brigh field microscopy)
●Microscopie à contraste de phase (phase-contrast microscopy)
●Microscopie en champ sombre (dark field microscopy)
●Microscope à contraste interférentiel ou Nomarski (differential interference contrast, Nomarski)

Question 16

Qu’est-ce que la microscopie en champ clair, ses 3 avantages et 3 limites?

Answer 16

● La microscopie la plus simple et la plus ancienne des techniques de microscopie
● L’illumination se fait par transmission de lumière blanche
● La lumière traverse directement ou est réfléchie par l’échantillon

Avantages: - Simple et pas chère
- Marqueurs de couleur peuvent
être utilisé
-Utilisation: échantillons fixés

Limites: - La plupart de cellules sont transparentes donc nécessité de marquage (teinture, toxicité potentiel)

• Faible contraste
• Résolution faible.

Question 17

Qu’est-ce que la microscopie à contraste de phase, ses 2 avantages, son utilisation et sa limitation?

Answer 17

●Technique qui met en valeur les différences d’indices de réfraction et de contraste
●Peut être utilisé pour visualiser des cellules vivantes sans teinture (non-toxique)
Avantages: -Peut être utilisée pour visualiser les cellules vivantes
-Pas besoin d’utiliser des produits chimiques ou préparation du tissue
-Utilisation: cellules en culture.
Limitation: Beaucoup de signaux hors focus.

Question 18

Qu’est-ce que la microscopie en champ sombre, ses 2 avantages, son utilisation et sa limitation?

Answer 18

●Permet d’améliorer le contraste d’échantillons transparents mais non teintés
●Le contraste provient de la lumière diffusée par l’échantillon
Avantages: - Peut être utilisée pour visualiser les cellules vivantes
-Bon rapport signal/bruit
-Utilisation: échantillons pour hybridation in situ (sondes radioactives).
Limitation: Limitée aux échantillons qui dispersent bien la lumière

Question 19

Qu’est-ce que la microscopie à contraste interférentiel (Nomarski), ses 3 avantages son utilisation et sa limitation?

Answer 19

●Utilise des modifications optiques pour exagérer les changements dans les propriétés de diffusion de lumière «scattering» des structures cellulaires
Avantage: - Peut être utilisée dans des cellules vivantes
-Bon rapport signal/bruit
-surligne les bords et les ombres de l’échantillon pour créer une apparence en trois dimensions (3D)
-Utilisation:cellules en culture et tissus.
Limitation: Limitée a l’imagerie d’un seul plan focal (mince) à la fois.

Question 20

Qu’est-ce que la microscopie à fluorescence et 4 types?

Answer 20

•Technique utilisant un microscope optique composé équipé d’un émetteur à laser qui permet la sélection d’une longueur d’onde précise
La + utilisée en neuro
• Les échantillons sont illuminés par une source de haute énergie (laser) et émettent de la lumière grâce à la présence de fluorophores. C’est le phénomène de fluorescence
• Microscopie à fluorescence standard
(epifluorescence)
• Microscopie à fluorescence confocale
• Microscopie à deux-photons (multiphotonique)
• Microscopie STED (déplétion par émission stimulée)

Question 21

Qu’est-ce qu’un fluorophore et comment ça fonctionne?

Answer 21

Un fluorophore est une substance chimique capable d’émettre de la fluorescence après excitation par la lumière.
•Les fluorophores peuvent être couplés aux protéines, anticorps ou d’autres sondes pour visualiser des molécules et structures dans une cellule.
Utilise certain lambda pour activer fluorophore (donner É) et fluorophore va perdre un peu de cette É et ensuite émettre de la lum
C’est la transition de l’É élevée à + basse qui permet l’émission de lum (émet quand tombe de niveau élevée à niveau basale)
Ya filtres dans microscope pour sélectionner lambda pour exciter et d’autres pour capter émission

Question 22

Qu’est-ce que la microscopie à fluorescence standard, son avantage et 3 limitations?

Answer 22

• La lumière passe à travers le filtre d’excitation qui permet le passage de lumière dans un rang spécifique de longueurs d’onde (dépendant du filtre)
• Cette lumière est absorbée par les fluorophores dans l’échantillon causant leur excitation ce qui produit l’émission d’une lumière de longueur d’onde plus large
• La lumière émise est capturée par l’objective et dirigée vers le filtre d’émission vers les éléments de détection (oeil, camera).
Avantage: acquisition des images relativement simple (par rapport a la microscopie confocale ou multi-photonique).
Limitations: • La lumière émise par le fluorophore diminue avec le temps (photoblanchiment)
•Pendant l’illumination des cellules vivantes, la lumière peut causer de la mort cellulaire (phototoxicité)
•Le bruit de fond peut être élevé a cause de la fluorescence non spécifique ou l’autofluorescence du tissu.

Question 23

Quels sont les 4 avantages de la microscopie à fluorescence?

Answer 23

• Peut être utilisée pour détecter de molécules marquée a la fluorescence
• Plusieurs fluorophores peuvent être utilise au même temps
• Très bon rapport signal/bruit
• Très sensible permettant la détection de molécules en faible quantité

Question 24

Qu’est-ce que la microscopie confocale, ses 3 avantages et 2 limitations?

Answer 24

•Le microscope confocale peut produire des images très claires des structures provenant d’un échantillon plus épais (>15-30μm)
•Utilise une illumination focalisée sur un point dans un profondeur spécifique de l’échantillon (plan focal) à différents niveaux de profondeur. Il est possible de réaliser des séries d’images à partir desquelles on peut obtenir une représentation tridimensionnelle de l’objet (z-stacks). L’objet n’est donc pas directement observé par l’utilisateur; celui-ci voit une image recomposée par l’ordinateur.
•Réalise des images de très faible profondeur de champ (environ 400nm) appelées «sections optiques». On parle alors de microscope confocale à balayage laser(MCBL).
Avantages: • Permet l’acquisition des images extrêmement nettes
• Seules les images dans le plan focal sont ramassées
• Permet l’imagerie des échantillons plus épais.
Limitations: •Le balayage requière une illumination des échantillons à long-terme ce qui augmente le phénomène de photoblanchiment
•La prise des images est un processus lent ce qui rend difficile la visualisation des évènements rapides

•Malgré ces limitations, la microscopie confocale est une technique extrêmement utile en neurosciences.

Question 25

Qu’est-ce qu’un microscope à 2 photons, ses 3 avantages et sa limitation?

Answer 25

• Le microscope à 2-photons est une variation plus sophistiquée de la microscopie à fluorescence
•En microscopie à fluorescence standard ou confocale, seulement un photon d’un certain longueur d’onde excite le fluorophore pour produire un signal. Dans la microscopie à 2-photons, un fluorophore peut être excité en absorbant deux photons simultanément
•La longueur d’onde de chaque photon est le double de la longueur d’onde nécessaire pour stimuler le fluorophore. Quand les 2 photons frappent le fluorophore chaque contribue la moitié de l’énergie nécessaire pour exciter le fluorophore
•Etant donné que l’arrivée de 2 photons est un évènement relativement rare, la fluorescence est localisée sur un plan focal très étroit dans l’échantillon ce qui donne des images plus claires (il n’y a pas assez d’énergie pour exciter d’autres plans alors le bruit de fond est très bas).
Avantages: •Le microscope à 2 photons permet la visualisation des cellules et des structures plus profondément (500 μm –1 mm).
•La longueur d’onde de la lumière excitatrice est typiquement dans le proche infra-rouge (700-1000 nm) rentrant plus facilement dans le tissu sans causer du dommage cellulaire (i.e. phototoxicité)
•L’excitation est limitée au point focal ce qui réduit grandement le photoblanchiment et permet l’observation des cellules pour long temps chez les animaux vivants
Limitation: la nécessité des équipements spécialisés et couteux (ex. microscopes multiphotonique >1M$).

Question 26

Qu’est-ce que la microscopie de l’épuisement d’émission stimulée (STED)?

Answer 26

• STED emploie une installation similaire à la microscopie confocale.
• Il se sert de deux rayons laser. Un pour exciter les bornes fluorescentes dans un échantillon et un pour l’épuisement.
• Produit des images à super-résolution par la désactivation sélective des fluorophores

Question 27

Qu’est-ce que la microscopie électronique et ses 2 limitations?

Answer 27

● Microscope qui utilise un faisceau de particules d’électrons pour illuminer un échantillon et en créer une image très agrandie en lieu d’un faisceau de photons
●Grossissement beaucoup plus élevés allant jusqu’à 5 millions de fois, alors que les meilleurs microscopes optiques sont limités à un grossissement de 2000 fois
● La longueur d’un électron est plus petite (plus d’énergie) que celle d’un photon
● Technique essentiel pour examiner les plus petites structures du système nerveux (ex. synapses, vésicules synaptiques, canaux ioniques)
Limitations: ●Les échantillons sont fixés, déshydratés et traités avec des agents chimiques (peu de chance de visualiser des cellules vivantes
●Présence des artefacts visuels causé par le traitement du tissue