Cours 9 - Cristallographie des protéines

Question 1

Quel est le principe de base de la cristallographie aux rayons X pour étudier les macromolécules biologiques ?

Answer 1

Un faisceau de rayons X est dirigé sur un cristal de la molécule (a), et l’analyse du diagramme de diffraction (b) permet de retrouver la structure tridimensionnelle (c) avec une résolution quasi-atomique.

Question 2

Quelles sont les étapes de la détermination de structure par cristallographie ?

Answer 2

1. Purification de la protéine
2. Préparation d’un cristal bien ordonné
3. Collection des spectres de diffraction
4. Détermination des phases
5. Construction d’un modèle préliminaire
6. Affinement du modèle
7. Validation de la structure

Question 2

À quoi sert la filtration sur gel dans la purification des protéines pour la cristallographie ?

Answer 2

Elle permet de changer de tampon et d’éliminer les protéines agrégées, préparant ainsi un échantillon homogène pour la cristallisation.

Question 3

Comment obtient-on un cristal bien ordonné à partir de protéines ?

Answer 3

En présence de certaines conditions, les protéines peuvent interagir entre elles pour former un réseau périodique et ordonné, c’est la base de la cristallisation.

Question 4

Qu’est-ce qu’une unité élémentaire (maille) dans un cristal ?

Answer 4

C’est la plus petite unité du cristal qui peut être répétée par translation pour générer tout le réseau cristallin.

Question 5

Combien de molécules de protéine contient un petit cristal ?

Answer 5

Un cristal de 100 µm de côté contient environ 10¹⁵ molécules de la protéine d’intérêt.

Question 6

Pourquoi la cristallisation est-elle l’étape la plus critique de la cristallographie ?

Answer 6

L’obtention de cristaux est souvent l’étape la plus longue et incertaine, car elle dépend de nombreux paramètres physiques et chimiques.

Question 6

Quelles sont les deux principales techniques de cristallisation des protéines ?

Answer 6

• Cristallisation par batch
• Cristallisation par diffusion de vapeur

Question 7

Comment fonctionne la cristallisation par batch ?

Answer 7

La protéine est mélangée directement à une grande quantité de solution mère contenant les ingrédients nécessaires à la cristallisation.

Question 8

Quelles sont les étapes de la cristallisation par diffusion de vapeur (goutte pendante) ?

Answer 8

1. Dépôt d’une petite goutte de protéine sur une lamelle
2. Ajout d’une quantité équivalente de solution mère
3. Mélange des deux (ex. 2 µL + 2 µL = 4 µL)
4. Scellage au-dessus d’un puit contenant la solution mère

Question 9

Que se passe-t-il après la fermeture du puit dans la cristallisation par diffusion de vapeur ?

Answer 9

Il y a équilibration : la goutte pendante se concentre en protéines et solutés, ce qui favorise la formation de cristaux.

Question 10

Comment les protéines forment-elles un cristal dans la méthode par diffusion de vapeur ?

Answer 10

Les protéines interagissent pour former des noyaux de cristallisation, qui croissent progressivement pour devenir de vrais cristaux.

Question 11

Qu’est-ce qu’un diagramme de phases en cristallisation ?

Answer 11

C’est une représentation graphique montrant la concentration de protéine en fonction de la concentration de l’agent précipitant, incluant une courbe de solubilité et une zone de supersaturation.

Question 12

Quels facteurs influencent la cristallisation des protéines ?

Answer 12

Le tampon (nature, concentration, pH), l’agent précipitant, les ions, le solvant, les ligands, la température, la concentration de protéine, ou même la protéine elle-même (mutants ou homologues).

Question 12

Quel est l’intérêt de la robotisation dans la cristallisation ?

Answer 12

Elle permet de tester rapidement un grand nombre de conditions, facilitant l’identification des conditions favorables à la cristallisation.

Question 13

Comment identifie-t-on les conditions de cristallisation à partir de protéines (hits) ?

Answer 13

Par criblage des conditions (screening), où l’on teste un grand nombre de conditions variées pour détecter les premières apparitions de cristaux.

Question 14

Comment optimise-t-on les conditions à partir de mini-cristaux (hits) ?

Answer 14

Par une optimisation ciblée, en modifiant progressivement les paramètres autour des conditions ayant donné des cristaux initiaux.

Question 14

Comment détermine-t-on le patron de diffraction à partir des cristaux ?

Answer 14

En exposant les cristaux à des rayons X, ce qui permet d’obtenir un diagramme de diffraction révélant la structure atomique.

Question 15

À quelle échelle se situent les interactions détectées par les rayons X en cristallographie ?

Answer 15

Les interactions sont de l’ordre de l’angström (10⁻¹⁰ m), soit un dixième de nanomètre, ce qui permet une résolution quasi-atomique.

Question 16

Quelle est la longueur d’onde des rayons X utilisés en cristallographie ?

Answer 16

Les rayons X ont une longueur d’onde d’environ 10⁻¹⁰ m, ce qui équivaut à 1 angström (1 Å) dans le spectre électromagnétique.

Question 17

Comment sont générés les rayons X utilisés en cristallographie ?

Answer 17

Les rayons X sont des radiations électromagnétiques à courte longueur d’onde, émises lorsqu’un électron perd de l’énergie en passant d’un niveau excité à un niveau plus bas.

Question 18

Comment fonctionne une source traditionnelle de rayons X en laboratoire ?

Answer 18

Elle utilise un tube à haute tension, où une anode métallique est bombardée par des électrons accélérés, ce qui émet un faisceau monochromatique de rayons X (longueur d’onde précise).

Question 19

Quelles sont les deux principales sources de rayons X utilisées en cristallographie ?

Answer 19

• Générateur de rayons X de laboratoire
• Synchrotron, source à haute intensité

Question 19

Quelles sont les caractéristiques d’un générateur de rayons X ?

Answer 19

Produit des rayons X monochromatiques (λ = 1,54 Å)

Faible intensité, une collecte de données prend environ une journée

Question 20

Quelles sont les caractéristiques d’un synchrotron ?

Answer 20

Produit des rayons X polychromatiques (λ = 0,5 – 2,5 Å) Forte intensité, permet de collecter les données en 5 minutes

Question 21

Que se passe-t-il lorsque le faisceau primaire de rayons X frappe le cristal ?

Answer 21

La majorité du rayonnement traverse le cristal, mais une partie est diffractée, ce qui permet l’analyse structurale.

Question 22

Comment les faisceaux diffractés sont-ils enregistrés ?

Answer 22

Les faisceaux sont captés par un détecteur, et les signaux sont transmis à un ordinateur pour analyse.

Question 23

Comment obtenir un jeu de données complet dans une expérience de diffraction ?

Answer 23

En tournant le cristal pendant l’exposition aux rayons X, on capte différentes orientations de diffraction.

Question 23

Que révèle un patron de diffraction ?

Answer 23

1. L’espacement entre les taches indique la taille de l’unité élémentaire 2. L’intensité des taches donne des infos sur la structure 3. La résolution est inversement proportionnelle à la distance des taches au centre

Question 24

Quel est le principe fondamental de l’interaction rayons X–matière ?

Answer 24

Les rayons X interagissent avec les électrons, entraînant une dispersion du faisceau incident

Question 25

Comment se manifeste la diffraction des rayons X par un seul atome ?

Answer 25

Un seul atome provoque une dispersion diffuse du faisceau, sans interférence nette.

Question 25

Pourquoi les atomes lourds dévient-ils plus les rayons X que les légers ?

Answer 25

Les atomes lourds (ex. Hg, Pb, U) ont plus d’électrons, donc dévient davantage les rayons X que les atomes légers (H, C, N, O).

Question 26

Comment plusieurs atomes dans un cristal diffractent-ils les rayons X ?

Answer 26

Ils provoquent des interférences : - Destructives si les ondes se neutralisent - Constructives si les ondes s’amplifient

Question 27

Pourquoi un cristal donne-t-il des patrons de diffraction nets ?

Answer 27

Parce que les atomes sont régulièrement espacés, ce qui cause une diffraction constructive dans certaines directions, formant les patrons de diffraction.

Question 28

Quelle est la loi mathématique qui décrit la condition de diffraction constructive ?

Answer 28

La loi de Bragg : n * λ = 2 * d * sin(θ) avec n = entier, λ = longueur d’onde, d = distance entre plans, θ = angle d’incidence

Question 28

Comment Sir Lawrence Bragg a-t-il interprété la diffraction par les cristaux ?

Answer 28

Il l’a modélisée comme une réflexion du faisceau par une série de plans parallèles, analogues à des miroirs réguliers.

Question 29

Dans quelles conditions observe-t-on une diffraction constructive ?

Answer 29

Lorsque les rayons réfléchis par des plans adjacents parcourent une distance multiple de la longueur d’onde (λ) → interférence constructive.

Question 30

Combien de taches de diffraction peut-on obtenir pour un petit cristal ?

Answer 30

Un cristal simple comme la myoglobine génère environ 20 000 taches, provenant de la diffusion par ~1 500 atomes.

Question 30

Quel outil mathématique utilise-t-on pour convertir les taches en positions atomiques ?

Answer 30

La transformée de Fourier permet de reconstituer la structure atomique à partir des taches de diffraction.

Question 31

Comment obtient-on les cartes de densité électronique à partir des données de diffraction ?

Answer 31

En utilisant les intensités et les phases des rayons X diffractés, la transformée de Fourier permet de générer des cartes de densité électronique et de construire les modèles atomiques.

Question 32

Comment obtient-on les cartes de densité électronique à partir des intensités et phases des rayons X diffractés ?

Answer 32

Grâce à la transformée inverse de Fourier, qui permet de reconstruire une carte de densité électronique à partir des intensités mesurées et des phases estimées.

Question 33

Quel est le problème majeur de la cristallographie concernant la phase ?

Answer 33

Les ondes diffractées sont définies par : - L’amplitude (proportionnelle à l’intensité des taches) - La longueur d’onde (déterminée par la source) - La phase, qui est perdue au cours de l’expérience. C’est le problème de détermination des phases.

Question 34

Quelle est la base de la méthode directe pour résoudre le problème de phase ?

Answer 34

La méthode directe consiste à calculer un patron théorique pour chaque configuration atomique possible et à le comparer au patron expérimental.

Question 34

Quelle est la principale limite de la méthode directe pour résoudre les phases ?

Answer 34

Cette méthode est seulement applicable aux petites molécules, car les calculs deviennent rapidement trop complexes pour les grosses protéines.

Question 35

En quoi consiste le remplacement isomorphe pour déterminer les phases ?

Answer 35

Il s’agit de tremper les cristaux dans une solution contenant des atomes lourds (ex. Hg, Pb, U) qui introduisent des modifications mesurables dans le patron de diffraction.

Question 36

Comment les atomes lourds interagissent-ils avec les protéines dans le remplacement isomorphe ?

Answer 36

Les métaux lourds se lient souvent aux acides aminés spécifiques comme les cystéines (Cys) et les histidines (His), permettant leur localisation dans la protéine.

Question 36

Pourquoi les atomes lourds sont-ils utiles pour résoudre les phases ?

Answer 36

Parce qu’ils ont plus d’électrons, ils provoquent une dispersion plus importante des rayons X, ce qui améliore la résolution du patron de diffraction.

Question 37

Comment obtient-on le patron de diffraction de l’atome lourd seul dans le remplacement isomorphe ?

Answer 37

En soustrayant le patron de diffraction du cristal natif à celui du cristal contenant l’atome lourd, on obtient le patron spécifique de l’atome lourd.

Question 38

Comment sont déterminées les phases après le remplacement isomorphe ?

Answer 38

Une fois le patron de l’atome lourd isolé, les phases peuvent être déduites à l’aide de la méthode directe, en combinant les nouvelles informations.

Question 38

Qu’est-ce que la dispersion anomale et comment l’utilise-t-on ?

Answer 38

On remplace un atome de la protéine (souvent la méthionine) par un atome lourd comme la sélénométhionine, qui permet de modifier la diffraction à certaines longueurs d’onde.

Question 39

Pourquoi utilise-t-on un synchrotron en dispersion anomale ?

Answer 39

Le synchrotron permet de sélectionner précisément une longueur d’onde à laquelle l’atome lourd entre en résonance, modifiant ses propriétés de diffraction.

Question 40

Comment obtient-on le patron de diffraction de l’atome lourd en dispersion anomale ?

Answer 40

En soustrayant les patrons obtenus à la longueur d’onde de résonance à ceux pris à une autre longueur d’onde, on isole l’effet de l’atome lourd.

Question 40

Qu’est-ce que le remplacement moléculaire et à quoi sert-il ?

Answer 40

Il consiste à utiliser la structure connue d’une protéine homologue (présente dans la PDB) pour obtenir les phases nécessaires à l’analyse d’une nouvelle protéine.

Question 41

Comment les phases sont-elles obtenues dans le remplacement moléculaire ?

Answer 41

Les intensités du patron expérimental sont combinées avec les phases calculées à partir de la structure homologue, ce qui permet une reconstruction du modèle.

Question 41

Qu’est-ce qu’une carte de densité électronique en cristallographie ?

Answer 41

C’est une carte de probabilité montrant la distribution des électrons à chaque point (x, y, z) dans l’unité élémentaire du cristal.

Question 42

Comment interprète-t-on les cartes de densité électronique ?

Answer 42

Grâce à une automatisation par logiciels spécialisés, mais aussi à une intervention humaine nécessaire pour valider et corriger le modèle.

Question 43

Quelles sont les étapes de construction d’un modèle cristallographique ?

Answer 43

1. Calculer la carte de densité électronique à partir des phases expérimentales ou par homologie 2. Interpréter la carte et modéliser les atomes 3. Valider et affiner le modèle 4. Recalculer les cartes avec les phases améliorées

Question 44

Que permet l’affinement du modèle si le cristal a une bonne résolution ?

Answer 44

Si la résolution est < 2,5 Å, la plupart des erreurs de structure peuvent être corrigées par un affinement cristallographique précis.

Question 45

Comment fonctionne l’affinement automatique du modèle ?

Answer 45

Des logiciels modifient le modèle pour réduire le facteur R, qui représente la différence entre les amplitudes expérimentales et celles calculées à partir du modèle.

Question 45

Qu’est-ce que le facteur R et que reflète-t-il ?

Answer 45

Le facteur R mesure la qualité du modèle cristallographique. - R = 0 → modèle parfait - R = 0,59 → désaccord total En pratique, une bonne structure a R ≈ 0,15 – 0,20.

Question 46

Quelles sont les causes possibles d’un facteur R imparfait après affinement du modèle cristallographique ?

Answer 46

Le facteur R imparfait peut provenir de : - Variations conformationnelles de la protéine - Corrections imprécises dues à la présence du solvant - Différences d’orientation des microcristaux - Erreurs de modélisation

Question 47

Quel est le biais des phases dans le modèle préliminaire ?

Answer 47

Les cartes de densité électroniques sont calculées à partir des intensités expérimentales (Fo) mais aussi des phases issues du modèle, ce qui introduit un biais de phase.

Question 47

Que représente la carte Fo en affinement cristallographique ?

Answer 47

La carte Fo est une carte biaisée représentant les intensités observées combinées avec les phases calculées à partir du modèle.

Question 47

Que représente la carte Fo – Fc ?

Answer 47

C’est une carte de différence, obtenue en soustrayant les intensités et phases calculées (Fc) du modèle à celles observées expérimentalement (Fo). Elle sert à visualiser les erreurs du modèle.

Question 48

Que représente la carte 2Fo – Fc ?

Answer 48

Cette carte combine deux fois les données expérimentales (Fo) avec les données du modèle (Fc). Elle est moins biaisée et permet une meilleure visualisation de la densité électronique.

Question 49

Comment obtient-on la carte 2Fo – Fc ?

Answer 49

Elle est obtenue par l’addition des cartes Fo et Fo – Fc, soit : 2Fo – Fc = Fo + (Fo – Fc)

Question 50

Que permet d’observer une structure cristallographique à basse résolution (5,0 Å) ?

Answer 50

À cette résolution, on peut seulement deviner la forme générale des hélices α, sans pouvoir localiser précisément les chaînes latérales.

Question 51

Que permet d’observer une structure à résolution moyenne (3,0 Å) ?

Answer 51

À 3,0 Å, on peut reconstruire le chemin de la chaîne peptidique et identifier certains types de chaînes latérales.

Question 52

Que permet d’observer une structure à haute résolution (1,5 Å) ?

Answer 52

On peut individualiser les atomes, mieux définir les chaînes latérales, identifier des molécules d’eau et même des ions métalliques.

Question 53

Que permet une résolution très haute (1,0 Å) en cristallographie ?

Answer 53

On peut distinguer des groupes comme OH, NH₂, CH₃, visualiser les liaisons hydrogène, les états de protonation, la dynamique moléculaire, et la position des molécules d’eau.

Question 54

À quoi sert le diagramme de Ramachandran ?

Answer 54

Il sert à analyser la conformation du squelette protéique en représentant les angles dièdres φ et Ψ de chaque acide aminé.

Question 55

Quelles sont les trois zones favorables dans le diagramme de Ramachandran ?

Answer 55

Les zones correspondant aux structures secondaires : - Hélices α - Feuillets β - Hélices gauches

Question 56

Quel critère est utilisé pour juger la qualité d’un ensemble de structures sur le diagramme de Ramachandran ?

Answer 56

Un bon ensemble de structures doit comporter au moins 90 % des acides aminés dans les zones favorables (zones rouge et jaune).

Question 57

Quels sont les avantages de la cristallographie des protéines ?

Answer 57

Grâce aux progrès technologiques (synchrotrons, ordinateurs puissants, constructions semi-automatiques des modèles), l’analyse des résultats est maintenant très rapide (si vous avez les phases !!). Des patrons de diffraction à haute résolution permettent d’obtenir des structures avec des détails très précis et de localiser les molécules d’eau et les ions. Il est possible d’étudier la structure de protéines de toutes tailles, seules ou sous forme de complexes moléculaires. On peut faire diffuser des petites molécules dans les cristaux et résoudre la structure du complexe.

Question 58

Quelles sont les limites de la cristallographie des protéines ?

Answer 58

Une grande quantité de protéine doit être purifiée Nécessite la production de cristaux ordonnés (tout-ou-rien) Les régions très flexibles sont rarement visibles en cristallographie Il peut être très difficile d’obtenir des cristaux qui diffractent à haute résolution, surtout pour les protéines ayant des segments dynamiques Les contacts cristallins sont parfois la source d’artefacts Les atomes d’hydrogène sont rarement visibles.