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BCM 2501 > Cours 7 - Expression des protéines 1 > Flashcards

Cours 7 - Expression des protéines 1 Flashcards

1
Q

Quels sont les facteurs importants à considérer pour l’expression et la purification des protéines ?

A
  1. Source de la protéine : (Bactérie, levure, cellules humaines, etc.).
  2. Niveau de pureté et quantité nécessaire en fonction de l’application.
  3. Types d’expériences prévues (activité enzymatique, structure, industrie, thérapie).
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2
Q

Quelles sont les exigences de pureté et de quantité de protéines en fonction de l’application ?

A

Études d’activité : µg – mg, 80-90% pureté.

Études de structure : 1-25 mg, ≥ 95% pureté.

Application industrielle : kg, pureté variable.

Application thérapeutique : kg, ≥ 99% pureté.

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3
Q

Quels sont les principaux compartiments cellulaires où l’on peut retrouver une protéine d’intérêt ?

A

Les protéines peuvent être localisées dans :

  • Membrane cellulaire.
  • Noyau.
  • Cytoplasme.
  • Réticulum endoplasmique.
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4
Q

Quelles sont les principales caractéristiques physico-chimiques des protéines à prendre en compte ?

A

Taille moléculaire.

Point isoélectrique (pI).

Modifications post-traductionnelles : Glycosylation, phosphorylation, méthylation.

Interaction avec métaux ou ligands.

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5
Q

Quelles sont les principales sources de protéines utilisées pour l’expression ?

A
  1. Tissus animaux.
  2. Bactéries (ex. E. coli).
  3. Levures (ex. Pichia pastoris).
  4. Cellules d’insectes (ex. Sf9).
  5. Cellules humaines (ex. HEK293).
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6
Q

Quels sont les avantages de l’isolement des protéines à partir de tissus animaux ?

A

Protéine native (conformation naturelle).

Présence de modifications post-traductionnelles.

Méthode peu coûteuse.

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6
Q

Quelles sont les étapes de l’isolement des protéines à partir de tissus animaux ?

A
  1. Localiser une source de protéine.
  2. Prélever l’organe optimal contenant la protéine d’intérêt.
  3. Homogénéiser les tissus pour libérer les protéines.
  4. Purifier la protéine via différentes méthodes de séparation.
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7
Q

Quelles sont les limites de l’isolement des protéines à partir de tissus animaux ?

A

Sources limitées.

Petite quantité de protéines spécifiques récupérables.

Absence d’étiquette (tag) facilitant la purification par chromatographie d’affinité.

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8
Q

Quels sont les avantages de l’expression de protéines dans la bactérie E. coli ?

A

Production rapide et peu coûteuse.

Milieux de culture économiques.

Grande variété de vecteurs d’expression disponibles (tags/étiquettes).

Facilité d’expression de protéines marquées (RMN et rayons X).

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9
Q

Quelles sont les étapes de l’expression de protéines dans une bactérie ?

A
  1. Construction du vecteur d’expression.
  2. Sélection des bactéries avec un antibiotique.
  3. Culture et induction de l’expression protéique avec IPTG.
  4. Purification et analyse de la protéine produite.
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10
Q

Quelles sont les limites de l’expression de protéines dans les bactéries ?

A

Absence de modifications post-traductionnelles (glycosylation, ponts disulfures).

Mauvaise expression des protéines membranaires.

Problèmes de codons rares chez les bactéries.

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11
Q

Comment peut-on surmonter les problèmes de codons rares en expression bactérienne ?

A

Optimisation des séquences de gènes pour la traduction en bactérie.

Utilisation de souches bactériennes modifiées avec surexpression des ARNt spécifiques aux codons rares.

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12
Q

Quelles sont les étapes de l’expression de protéines dans la levure (Pichia pastoris) ?

A
  1. Construction du vecteur d’expression.
  2. Sélection avec un acide aminé spécifique.
  3. Culture et induction de l’expression avec méthanol (MeOH).
  4. Purification et analyse de la protéine produite.
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13
Q

Quelles sont les limites de l’expression de protéines dans la levure ?

A

Plus lent que la bactérie (culture de 3 à 5 jours).

Différences dans l’usage des codons par rapport aux cellules humaines.

Mauvaise expression des protéines fortement glycosylées.

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14
Q

Quels sont les avantages de l’expression de protéines dans la levure ?

A

Production relativement économique.

Possibilité de formation de ponts disulfures.

Capacité à effectuer certaines modifications post-traductionnelles (ex. phosphorylation).

Possibilité d’exprimer des protéines marquées (RMN).

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15
Q

Quels sont les avantages de l’expression de protéines dans les cellules d’insectes ?

A

Présence de ponts disulfures et modifications post-traductionnelles.

Très efficace pour les protéines glycosylées.

Possibilité d’utiliser des vecteurs avec His-tag ou GST-tag.

Bon usage des codons, idéal pour les grandes protéines humaines.

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15
Q

Quelles sont les étapes de l’expression de protéines dans les cellules d’insecte (Sf9) ?

A
  1. Construction du vecteur en bactérie.
  2. Identification et amplification du baculovirus.
  3. Culture et infection des cellules d’insecte (Sf9).
  4. Purification et analyse de la protéine.
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16
Q

Quelles sont les limites de l’expression de protéines dans les cellules d’insectes ?

A

Procédure plus lente (1-2 semaines).

Rendement plus faible en protéines.

Milieux de culture coûteux.

Difficulté à produire des protéines marquées.

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16
Q

Quelles sont les étapes de l’expression de protéines dans les cellules humaines (HEK293) ?

A
  1. Construction du vecteur d’expression (pTT).
  2. Production du vecteur en bactérie.
  3. Culture et transfection des cellules humaines (HEK293).
  4. Purification et analyse de la protéine recombinante.
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17
Q

Quelles sont les caractéristiques du vecteur pTT utilisé pour l’expression dans les cellules humaines ?

A

Permet une expression intracellulaire ou une sécrétion extracellulaire.

Jusqu’à 10 fois plus efficace que le vecteur pCDNA.

Capacité de production de 20 à 60 mg de protéine recombinante par litre.

Inclut souvent des His-TAG pour la purification.

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18
Q

Quelles sont les limites de l’expression de protéines dans les cellules humaines ?

A

Processus lent (1-2 semaines).

Faible rendement en protéines.

Nécessité d’un fermenteur pour la production en grande quantité.

Milieux de culture coûteux.

Impossible de produire des protéines marquées pour la RMN ou les rayons X.

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18
Q

Quelles sont les caractéristiques des cellules HEK293-E6 pour l’expression de protéines humaines ?

A

Aucun problème de codon rare, idéal pour l’expression de protéines humaines.

Surexpression des chaperons, favorisant un repliement optimal.

Croissance en suspension, permettant d’atteindre des densités cellulaires plus élevées.

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19
Q

Quels sont les avantages de l’expression de protéines dans les cellules humaines ?

A

Capacité de réaliser des modifications post-traductionnelles (ponts disulfures, glycosylation).

Bonne expression des protéines membranaires.

Les protéines produites ne sont pas immunogènes.

Vecteurs d’expression avec His-tag disponibles.

Idéal pour les grandes protéines humaines grâce à l’utilisation de codons optimisés.

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20
Q

Quelle est la meilleure méthode pour exprimer une petite protéine avec des ponts disulfures ?

A

Levure en premier choix.

Si pas d’expression, optimisation des codons ou utilisation de Sf9 ou HEK293.

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21
Quelle est la meilleure méthode d’expression pour une petite protéine ou un domaine ?
Bactérie en premier choix. Si pas d’expression, optimisation des codons ou utilisation de Sf9 ou HEK293.
22
Quelle est la meilleure méthode pour exprimer une protéine membranaire ?
Sf9 (cellules d’insecte) ou HEK293 (cellules humaines).
23
Quelle est la meilleure méthode pour la production de protéines à usage thérapeutique ?
HEK293, car elles permettent des modifications post-traductionnelles fidèles aux protéines humaines.
23
Quelle est la meilleure méthode pour exprimer une grosse protéine humaine ?
Sf9 (cellules d’insectes) ou HEK293 (cellules humaines).
24
Quelle est la meilleure méthode pour exprimer des protéines marquées pour RMN ou rayons X ?
Bactérie (E. coli) ou Levure (Pichia pastoris).
25
Que faire avec le culot après suspension et lyse des cellules en purification de protéines ?
Lavage avec détergents si présence de corps d’inclusion. Solubilisation avec agents chaotropiques (ex. guanidinium, urée). Purification limitée. Renaturation de la protéine et essais biologiques pour vérifier l’activité.
26
Que faire avec le surnageant après suspension et lyse des cellules en purification de protéines ?
Protéines solubles sont directement purifiées. Purification illimitée avec les méthodes standards de chromatographie.
27
Quelles sont les trois grandes étapes du schéma de purification des protéines solubles ?
1. Capturer : Isoler et concentrer la protéine. 2. Purifier : Retirer les grosses impuretés. 3. Polir : Éliminer les petites impuretés pour affiner la pureté.
28
Quelles techniques sont utilisées pour capturer et isoler une protéine en purification ?
Précipitation saline. Chromatographie d’affinité. Chromatographie par échange d’ions.
29
Quelles techniques sont utilisées pour polir et affiner la pureté d’une protéine ?
Chromatographie par filtration sur gel. Chromatographie en phase inverse.
29
Quelles techniques sont utilisées pour purifier une protéine en retirant les grosses impuretés ?
Chromatographie d’affinité. Chromatographie par échange d’ions.
30
Quelles sont les étapes du schéma de purification des protéines sous forme de corps d’inclusion ?
1. Suspension des corps d’inclusion avec urée (8M) ou guanidinium (6M). 2. Isolation du surnageant contenant la protéine solubilisée. 3. Purification en deux étapes (ex. échange d’ions, affinité). 4. Renaturation dans un tampon physiologique. 5. Vérification de l’activité biologique.
31
Quels types de chromatographie peuvent être réalisés en présence de guanidinium ?
Chromatographie d’affinité (His-tag). Chromatographie par filtration sur gel.
31
Quels types de chromatographie peuvent être réalisés en présence d’urée ?
Chromatographie par échange d’ions. Chromatographie d’affinité (His-tag). Chromatographie par filtration sur gel.
32
Quel est l'effet de l'ajout de sels comme le sulfate d’ammonium sur la solubilité des protéines ?
L’augmentation de la concentration en sels entraîne une diminution de la solubilité des protéines. Ce phénomène est utilisé en précipitation saline pour concentrer et isoler les protéines.
32
Quelles sont les méthodes de chromatographie les plus courantes pour purifier les protéines ?
1. Chromatographie d'affinité. 2. Chromatographie par échange d’ions. 3. Chromatographie par filtration sur gel. 4. Chromatographie en phase inverse.
32
Quels sont les principaux agents chaotropiques utilisés en purification de protéines ?
Guanidinium et Urée.
32
Quels sont les tampons et additifs couramment utilisés pour la purification des protéines ?
Tampons physiologiques : pH 6.0 - 9.0, Tris-HCl, Phosphate, HEPES. Sels : NaCl, KCl (150 - 250 mM pour stabilité). Dénaturants : Urée (1-8 M), Guanidinium (1-6 M). Inhibiteurs de protéases : Mélange standard pour protéger la protéine. Antioxydants : DTT (dithiothréitol), BME (β-mercaptoéthanol) pour stabiliser les ponts disulfures.
33
Quelles sont les étapes de la précipitation saline des protéines ?
1. Commencer avec la fraction soluble. 2. Augmenter progressivement la concentration de sulfate d’ammonium de 10% à la fois. 3. Centrifuger et resurprendre le culot pour analyse. 4. Répéter les étapes 2 et 3 jusqu’à 80-90% de sulfate d’ammonium. 5. Effectuer une électrophorèse pour identifier les culots contenant la protéine d’intérêt. 5. Resuspendre les culots sélectionnés dans le tampon original pour purification supplémentaire.
34
Quelles sont les caractéristiques principales de la FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) ?
Fonctionne à pression moyenne (1500-3000 psi max). Débit faible à rapide, adapté à la purification de protéines. Utilise des tubes en PEEK, un polymère résistant aux produits chimiques.
34
Quelles sont les caractéristiques principales de la HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) ?
Fonctionne à haute pression (jusqu’à 6000 psi). Débit très faible à rapide, idéal pour les petites molécules et peptides. Utilise des tubes en acier ou titane, plus résistants aux hautes pressions.
35
Qu'est-ce que l'élution linéaire en chromatographie et quels sont ses avantages et inconvénients ?
Un seul tampon utilisé (Tampon A). Avantages : - Protocole plus simple. - Équipement moins coûteux. Inconvénients : - Séparation moins efficace comparée à l’élution par gradient.
36
Qu'est-ce que l'élution par gradient en chromatographie et quels sont ses avantages et inconvénients ?
Utilisation de deux tampons ou plus pour faire varier les conditions de séparation. Avantages : - Séparation plus efficace. Inconvénients : - Protocole plus complexe. - Équipement plus coûteux.
37
Quels sont les filtres UV les plus utilisés pour la détection des protéines ?
214 nm ou 228 nm : Très sensible, détecte les liaisons amides de tous les acides aminés. 254 nm : Moins sensible, détecte uniquement les groupes aromatiques de Phe, Tyr, et Trp. 280 nm : Détecte spécifiquement les groupes aromatiques de Tyr et Trp.
37
Quelle est la relation entre l’absorption UV et la concentration en protéines selon la loi de Beer-Lambert ?
La loi de Beer-Lambert établit une relation linéaire entre l'absorption de la lumière et la concentration des espèces absorbantes
38
Quels types de groupes fonctionnels des protéines absorbent dans l’ultraviolet ?
Les groupes amides et certains groupes fonctionnels absorbent en dessous de 250 nm. Les acides aminés aromatiques (Trp, Tyr, Phe) absorbent fortement au-dessus de 250 nm.
39
Pourquoi la chromatographie d’affinité est-elle particulièrement efficace en purification ?
Très bonne méthode pour les premières étapes de purification : - Capturer (isoler et concentrer la protéine). - Purifier (éliminer les grosses impuretés).
40
Quel est le principe de la chromatographie d’affinité ?
Basée sur une liaison spécifique et réversible entre une protéine et une résine. Exploite une propriété biochimique unique de la protéine d’intérêt pour la purification.
41
Quels sont les deux types principaux de protéines ciblées par la chromatographie d'affinité ?
Protéines natives ayant une affinité naturelle pour un ligand (ex. ATP, NADP, métaux). Protéines de fusion qui ont été génétiquement modifiées pour interagir avec un ligand spécifique (ex. GST, His-tag, MBP).
42
Donnez des exemples de protéines de fusion purifiées par chromatographie d'affinité et leur ligand correspondant.
Glutathion-S-transférase (GST) → Glutathion. His-tag (6xHis) → Nickel (Ni²⁺). Protéine de liaison au maltose (MBP) → Maltose.
42
Donnez des exemples de protéines natives purifiées par chromatographie d’affinité et leur ligand correspondant.
Enzymes utilisant NADP⁺ → Orcion rouge. Protéines liant l’ATP → ATP. Protéines liant le GTP → GTP. Protéines liant les métaux → Zn²⁺, Ca²⁺.
43
Quel est le rôle du bras espaceur en chromatographie d'affinité ?
Réduit les interactions non spécifiques entre la protéine et la matrice. Augmente l’accessibilité du ligand pour la protéine cible.
44
Quelles sont les étapes de préparation d’une résine d'affinité ?
1. Fixation d’un ligand d’affinité spécifique à la protéine d’intérêt. 2. Ajout d’un bras espaceur pour minimiser les interactions non spécifiques.
45
Quelles sont les étapes du protocole de chromatographie d'affinité ?
1. Équilibration : La colonne est préparée avec un tampon de liaison. 2. Liaison : L’échantillon est appliqué, seules les protéines ayant une affinité pour le ligand restent fixées. 3. Élution : Un tampon contenant un compétiteur est utilisé pour libérer la protéine purifiée.
46
Comment fonctionne la purification d'une protéine de fusion GST en chromatographie d'affinité ?
GST est fusionné à la protéine d’intérêt avec un site de coupure de protéase entre les deux. Fixation sur la résine au glutathion. Hydrolyse enzymatique pour libérer la protéine cible.
47
Quels sont les avantages de la fusion GST pour la purification des protéines ?
Augmente la solubilité de la protéine. Purification rapide et facile avec la résine au glutathion. Élution facile avec un petit ligand comme le glutathion.
48
Quels sont les désavantages de la fusion GST pour la purification des protéines ?
Grosse étiquette/tag (~250 acides aminés, 26 kDa). Purification impossible avec des dénaturants. Formation de dimères par GST, ce qui peut interférer avec les essais biologiques.
49
Pourquoi est-il parfois nécessaire de cliver la protéine de fusion après la purification ?
Les grandes protéines de fusion (ex. GST, MBP) peuvent affecter la fonction de la protéine purifiée. Le site de coupure est généralement inclus dans le vecteur utilisé pour l'expression. Il est important de vérifier qu'aucun site de coupure supplémentaire pour la protéase choisie ne soit présent dans la protéine cible.
50
Quelles sont les trois protéases les plus utilisées pour cliver les protéines de fusion ?
1. Thrombine. 2. Facteur Xa. 3. Protéase TEV (Tobacco Etch Virus – protéase du virus de la mosaïque du tabac).
51
Quel est le compétiteur utilisé pour l’élution des protéines fusionnées à une polyhistidine en chromatographie d’affinité ?
L'imidazole en excès remplace la liaison entre la protéine polyhistidine et le Ni²⁺ de la résine.
52
Comment est structurée la résine utilisée pour la purification des protéines polyhistidine ?
Le ligand d’affinité est le Ni²⁺. Un bras espaceur relie le Ni²⁺ à la surface de la résine, minimisant les interactions non spécifiques.
53
Quels sont les avantages de la fusion polyhistidine pour la purification des protéines ?
Purification facile avec résine de nickel. Élution facile avec un petit ligand (imidazole). Compatible avec les détergents et les dénaturants. Petite étiquette/tag (6 acides aminés), donc peu d'effet sur la protéine cible.
54
Quelles sont les propriétés essentielles d’un bon compétiteur en chromatographie d'affinité ?
Doit se lier spécifiquement à la résine ou au tag. Doit permettre une liaison facilement réversible. Doit être chimiquement stable et inerte. Ne doit pas être trop cher. Doit être de petite taille moléculaire, facilitant son élimination par dialyse après la purification.
54
Qu'est-ce que la dialyse et comment est-elle utilisée en chromatographie d'affinité ?
La dialyse permet d'éliminer les compétiteurs après purification. Le compétiteur est présent à forte concentration dans le tube de dialyse, entouré d'une solution tampon. Au fil du temps, le compétiteur diffuse hors du tube de dialyse, tandis que la protéine purifiée reste à l'intérieur.
54
Quels sont les désavantages de la fusion polyhistidine ?
Augmente la formation de corps d’inclusion dans les bactéries. Incompatible avec les antioxydants (ex. DTT), qui réduisent le Ni²⁺. Pas adapté aux protéines qui lient des métaux de transition, car elles pourraient interagir avec la résine de nickel.
55
Quels sont les deux principaux compétiteurs utilisés en chromatographie d'affinité ?
1. Imidazole en excès : utilisé pour les protéines polyhistidine, où l'imidazole se lie au Ni²⁺. 2. Glutathion en excès : utilisé pour les protéines fusionnées à GST, où le glutathion libre se lie au GST et provoque l’élution de la protéine d'intérêt.

BCM 2501 (13 decks)

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