Cours 8 - Expression des protéines 2 Flashcards by Léane Roseberry

Quel est le principe de base de la chromatographie par échange d’ions ?

La chromatographie par échange d’ions repose sur une interaction électrostatique entre les ions de charges opposées.

On exploite les groupes chargés des protéines d’intérêt pour les séparer des autres composants d’un mélange.

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Quels sont les deux types de chromatographie par échange d’ions ?

Il existe deux formes principales :

Chromatographie par échange de cations : retient les molécules chargées positivement.
Chromatographie par échange d’anions : retient les molécules chargées négativement.

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Quelles sont les trois étapes du processus de chromatographie par échange d’ions ?

Capturer : Isolement et concentration de la protéine cible.
Purifier : Élimination des grosses impuretés.
Polir : Élimination des petites impuretés résiduelles.

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Comment varient les colonnes et les résines utilisées aux différentes étapes de la chromatographie par échange d’ions ?

Première étape : Utilisation d’une grosse colonne avec une résine à haute capacité.
Deuxième étape : Utilisation d’une colonne plus petite avec une résine plus uniforme et de plus petites particules pour une meilleure précision.

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Comment les protéines interagissent-elles avec la résine dans la chromatographie par échange d’ions ?

Les groupes chargés des protéines se lient à une résine qui porte une charge opposée, ce qui permet leur séparation selon leur charge nette.

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Quel est l’impact de la charge nette d’une molécule sur son adsorption à la résine ?

Plus une molécule a une grande charge nette, plus elle aura une forte adsorption à la résine.

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Quelles sont les deux méthodes principales pour désorber une protéine de la résine ?

Diminuer la charge nette de la protéine en modifiant le pH.
Ajouter des ions compétitifs (ex. NaCl ou KCl) pour remplacer la protéine liée.

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Quel est l’effet d’une augmentation de la charge nette d’une protéine sur sa désorption ?

Une augmentation de la charge nette nécessite une concentration plus élevée en sels pour désorber la protéine de la résine.

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Quelle est la nature du groupe fonctionnel et le pKa moyen de l’acide aspartique ?

Groupe fonctionnel : Carboxyle (-COOH).

pKa moyen : 4,5.

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Quelle est la nature du groupe fonctionnel et le pKa moyen de l’acide glutamique ?

Groupe fonctionnel : Carboxyle (-COOH).

pKa moyen : 4,6.

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Quelle est la nature du groupe fonctionnel et le pKa moyen de l’arginine ?

Groupe fonctionnel : Guanidinium (-C(NH₂)₂NH⁺).

pKa moyen : 12.

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Quelle est la nature du groupe fonctionnel et le pKa moyen de la lysine ?

Groupe fonctionnel : Ammonium (-NH₃⁺).

pKa moyen : 10,4.

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Quels sont les principaux échangeurs d’anions en chromatographie par échange d’ions ?

Diethylaminoethyl (DEAE).
Quaternary aminoethyl (QAE).
Quaternary ammonium (Q).

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Quelle est la nature du groupe fonctionnel et le pKa moyen de l’histidine ?

Groupe fonctionnel : Imidazole.

pKa moyen : 6,2.

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Quels sont les principaux échangeurs de cations en chromatographie par échange d’ions ?

Carboxyméthyl (CM).
Sulfopropyl (SP).
Méthyl sulfonate (S).

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Quelles sont les principales étapes d’une purification par chromatographie par échange d’ions ?

Équilibration : Utilisation d’un tampon d’équilibrage (tampon A).
Application de l’échantillon : Mélange avec le tampon de lyse (tampon A).
Élution par gradient : Ajout progressif d’un tampon B contenant du sel :
- 25% tampon B.
- 50% tampon B.
- 75% tampon B.
Régénération : Passage à 100% tampon B, puis retour à 100% tampon A.

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Quels sont les principaux avantages de la chromatographie par échange d’ions ?

Grande flexibilité (possibilité d’ajuster le sel et le pH).

Choix entre échangeur cationique et anionique.

Disponibilité de nombreuses résines.

Faible coût des résines.

Compatible avec des détergents non chargés et l’urée.

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Quelles sont les limites de la chromatographie par échange d’ions ?

Manque de spécificité : elle ne permet pas toujours une séparation fine.

Incompatibilité avec la guanidine, qui est chargée.

Nécessite un système de chromatographie avec deux pompes (FPLC) pour une performance optimale.

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Sur quel principe repose la chromatographie par filtration sur gel ?

La chromatographie par filtration sur gel repose sur une séparation basée sur la taille moléculaire. Les gels poreux permettent aux petites molécules de pénétrer, tandis que les grosses molécules sont exclues et migrent plus rapidement.

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Quelles sont les trois étapes principales de la chromatographie par filtration sur gel ?

Capturer : Isoler et concentrer la protéine d’intérêt.
Purifier : Retirer les grosses impuretés.
Polir : Éliminer les petites impuretés résiduelles.

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Comment les protéines interagissent-elles avec la phase mobile et la phase stationnaire en chromatographie par filtration sur gel ?

Les protéines sont partitionnées entre :

La phase mobile : transport des protéines dans la colonne.
La phase stationnaire : gels poreux où les petites protéines pénètrent et migrent lentement, alors que les grosses protéines passent rapidement.

Quelles sont les étapes de la chromatographie par filtration sur gel ?

Équilibration : Utilisation du tampon A (tampon d’équilibration).
Application de l’échantillon : Mélange avec le tampon d’application.
Élution : Avec le même tampon (tampon d’élution A) pour entraîner les protéines hors de la colonne.

Quels sont les avantages de la chromatographie par filtration sur gel ?

Grande variété de résines (différentes tailles de particules et gammes de séparation).

Faible coût des résines.

Compatible avec les détergents et les dénaturants.

Bonne méthode pour purifier des protéines issues de corps d’inclusion.

Équipement peu coûteux et possibilité d’élution linéaire.

Quelles sont les limites de la chromatographie par filtration sur gel ?

Peu efficace pour purifier de grandes quantités de protéines.

Résines fragiles et peu durables.

Vitesses d’écoulement très faibles, ce qui ralentit l’analyse.

Sur quel principe repose la chromatographie en phase inverse ?

La séparation est basée sur les interactions hydrophobes. La désorption des protéines se fait à l’aide d’un solvant organique, ce qui permet de les libérer de la résine.

Quelles sont les trois étapes principales de la chromatographie en phase inverse ?

1. Capturer : Isoler et concentrer la protéine d’intérêt. 2. Purifier : Retirer les grosses impuretés. 3. Polir : Éliminer les petites impuretés.

Quel est le rôle de l’équilibre réversible dans l’adsorption des protéines en chromatographie en phase inverse ?

L’adsorption des protéines sur la résine est réversible et dépend du changement de polarité du solvant : - Une augmentation de la concentration du solvant organique entraîne la désorption des protéines.

Comment se déroule l’élution en chromatographie en phase inverse ?

1. Équilibration : Tampon A avec faible concentration de solvant organique. 2. Application de l’échantillon : Utilisation du même tampon A. 3. Élution : Augmentation progressive de la concentration du solvant organique. 4. Régénération : Utilisation du tampon B (100% solvant organique).

Quel type de colonne est utilisé en chromatographie en phase inverse pour différentes tailles de protéines ?

Petites protéines : Colonne C18. Grosses protéines : Colonne C2 ou C1.

Quels sont les avantages de la chromatographie en phase inverse ?

Bonne résolution grâce à la diversité des résines. Compatible avec la purification des protéines dans les corps d’inclusion. Résines résistantes et durables. Adaptable à différentes vitesses d’écoulement (faible à rapide).

Quelles sont les limites de la chromatographie en phase inverse ?

Colonnes coûteuses. Inadaptée aux grosses protéines ou aux protéines trop hydrophobes. Risque de dénaturation de la protéine d’intérêt. Équipement très cher (HPLC).

Quelle méthode est utilisée pour déterminer la concentration d’une protéine ?

Absorption UV à 280 nm, méthode très précise si la séquence de la protéine est connue.

Qu’est-ce que le coefficient d’extinction molaire (ε) en spectrophotométrie des protéines ?

C’est une constante qui exprime l’absorbance spécifique d’une protéine à 280 nm, en unités de M⁻¹ cm⁻¹.

Quelle est la loi utilisée pour calculer la concentration d’une protéine à partir de son absorbance UV ?

La loi de Beer-Lambert : A=εlC où : - A = Absorbance (sans unité). - l = Longueur de la cuve (généralement 1 cm). - C = Concentration (mol.L⁻¹). - ε = Coefficient d’extinction molaire (L.mol⁻¹.cm⁻¹).

Quelle technique est utilisée pour déterminer la pureté d’une protéine ?

Électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE), où : - Les protéines sont séparées selon leur taille moléculaire. - Utilisation du dénaturant SDS (Sodium Dodecyl Sulfate). - Méthode très précise, mais la sensibilité dépend du type de détection utilisé.

Quels sont les types de coloration utilisés pour détecter les protéines après SDS-PAGE ?

Bleu de Coomassie Brilliant. Coloration à l’argent (plus sensible).

Quelle technique permet de vérifier l’identité d’une protéine avec une très grande précision ?

La spectrométrie de masse, une méthode très précise et sensible, mais nécessitant un équipement coûteux.

Quelles sont les méthodes standards pour la synthèse de l’ARN ?

Synthèse chimique : Limitée aux petits ARN. Synthèse enzymatique in vitro : Utilisation de l’ARN polymérase du bactériophage T7.

Quelles sont les étapes de purification de l’ARN polymérase T7 ?

1. Construction d’un vecteur d’expression avec une fusion His-tag. 2. Purification sur résine de nickel. 3. Purification par échange d’anions à pH 8,0. 4. Purification par filtration sur gel. 5. Vérification de la pureté.

Quels sont les avantages de la purification de l’ARN par gel d’électrophorèse dénaturant ?

Très bonne résolution des fragments d’ARN. Ne nécessite pas d’instruments de chromatographie. Permet de purifier de grandes quantités d’ARN (plusieurs mg).

Quelles sont les limites de la purification de l’ARN par gel d’électrophorèse dénaturant ?

Procédure longue et fastidieuse. Dénaturation systématique de l’ARN. Risque de contamination par des oligomères d’acrylamide.

Quel est l’avantage principal de la purification de l’ARN par chromatographie d’affinité ?

Elle permet une purification très rapide grâce à des approches récentes qui améliorent le rendement et la pureté de l’ARN d’intérêt.

Que contient un ARN de fusion utilisé pour la purification par chromatographie d’affinité ?

Un ARN de fusion contient : - L’ARN d’intérêt. - Un tag qui facilite l’interaction avec une résine d’affinité.

Quelle est une exigence importante pour la purification de l’ARN par chromatographie d’affinité ?

Toutes ces approches nécessitent l’expression initiale d’un ARN de fusion, combinant l’ARN cible et un tag spécifique pour l’affinité.

Quel est le rôle du tag dans la purification de l’ARN par chromatographie d’affinité ?

Le tag contient une séquence d’ARN avec une forte affinité pour une protéine ou un peptide, ce qui permet de capturer l’ARN spécifique sur une colonne d’affinité.

Comment fonctionne la résine utilisée dans la purification de l’ARN par chromatographie d’affinité ?

La résine est conçue avec une protéine ou un peptide fixé, ayant une forte affinité pour le tag de l’ARN de fusion, permettant ainsi sa rétention et sa purification.

Quel est l’objectif de la méthode de purification par affinité avec le ARiBo-Tag

La méthode ARiBo-Tag a été développée pour optimiser le rendement et la pureté de l’ARN produit via transcription in vitro par l’ARN polymérase du bactériophage T7, avec un ARN fusionné à un ARiBo-tag.

Quelles sont les étapes principales de la purification par affinité avec ARiBo-Tag ?

1. Transcription in vitro de l’ARN fusionné au ARiBo-Tag. 2. Immobilisation de l’ARN sur une résine d’affinité. 3. Auto-clivage induit par GlcN6P (Glucosamine-6-Phosphate). 4. Élution de l’ARN d’intérêt.

Quel ribozyme est utilisé pour le clivage de l’ARN dans la méthode ARiBo-Tag ?

Le ribozyme glmS assure un clivage spécifique au niveau de l’ARN d’intérêt, permettant sa libération de l’ARN de fusion.

Quel est le rôle de la résine GSH dans la purification par affinité avec le ARiBo-Tag ?

La résine GSH (Glutathion-Sépharose) est utilisée pour capturer l’ARN fusionné via l’interaction avec GST-lambdaN sur le site lambda boxB, facilitant ainsi la purification sélective de l’ARN d’intérêt.