Cours 12 - Caractérisation des interactions Flashcards
1
Q
Que permettent les interactions entre les composantes de la machinerie biochimique des cellules ?
A
Elles organisent la matière, l’information et les transformations d’énergie pour permettre des fonctions spécifiques dans la cellule.
2
Q
Quelle est l’équation d’équilibre pour la liaison d’un ligand X à une macromolécule M ?
A
L’équation est : M + X ⇌ MX ; où [MX] est la concentration de la forme liée, [M] celle de la forme libre de la macromolécule, et [X] celle du ligand libre.
3
Q
Comment calcule-t-on la constante d’association Ka d’une liaison M-X ?
A
Ka = [MX] / ([M] × [X]), soit le rapport entre la concentration du complexe lié et le produit des concentrations libres.
4
Q
Quelle est la formule de la constante de dissociation Kd ?
A
Kd = 1 / Ka = ([M] × [X]) / [MX], représentant l’affinité inverse de la liaison entre la macromolécule et le ligand.
5
Q
Comment calcule-t-on le pourcentage de macromolécule liée à un ligand ?
A
%M lié = ([MX] / ([M] + [MX])) × 100 %, soit la proportion de macromolécule dans le complexe par rapport au total.
6
Q
Comment calcule-t-on le pourcentage de ligand lié ?
A
%X lié = ([MX] / ([X] + [MX])) × 100 %, soit la proportion du ligand engagé dans le complexe.
7
Q
Quelles sont les données clés sur les protéines chez E. coli ?
A
E. coli contient ~2 600 000 protéines par cellule dans un volume aqueux de 7×10⁻¹⁶ L, avec une concentration totale de 200–320 mg/mL (5–8 mM).
8
Q
Quelle est la variation d’abondance d’une protéine donnée dans le cytosol de E. coli ?
A
Elle peut varier d’environ 100 à 10⁵ copies par cellule.
9
Q
Quelles sont les valeurs typiques de KD pour une liaison protéine-ligand efficace in vivo ?
A
Des valeurs de KD efficaces in vivo se situent typiquement entre le nanomolaire (nM) et le micromolaire (µM).
10
Q
Quelle est la condition d’efficacité d’une interaction protéine/protéine in vivo selon la valeur de KD ?
A
Une interaction est généralement efficace in vivo si KD ≤ 10⁻⁶ M.
11
Q
Quelle est la plage de variation des valeurs de KD dans les systèmes biologiques ?
A
Les KD varient entre 10⁻⁴ M et 10⁻¹⁶ M selon les systèmes biologiques.
12
Q
Quels facteurs influencent la formation de complexes macromoléculaires in vivo ?
A
Les facteurs déterminants sont :
- Les conditions physico-chimiques du milieu cellulaire
- Le bon repliement des macromolécules
- La compartimentalisation cellulaire et l’accessibilité des macromolécules et de leurs ligands
- Les modifications covalentes des macromolécules
- La présence de cofacteurs impliqués dans la liaison ou l’activité
13
Q
Quels paramètres physico-chimiques cellulaires influencent la formation des complexes ?
A
Les conditions physico-chimiques du milieu cellulaire comprennent :
- La densité macromoléculaire
- La concentration en sels
- Le pH
- La température
14
Q
Quelles sont les modifications covalentes des macromolécules pouvant influencer les interactions ?
A
- Phosphorylation
- Acétylation
- Ubiquitination des protéines
- Activation par des protéases
- Édition
- Uridylation
- Polyadénylation des ARN
15
Q
Quels types d’interactions sont ciblés pour identifier les partenaires d’interaction in vivo ?
A
- Les interactions protéine-protéine
- Les interactions ADN/protéine
- Les interactions ARN-protéine
16
Q
Quelles méthodes permettent d’identifier les interactions protéine-protéine in vivo ?
A
- La co-immunoprécipitation
- L’essai de marquage par proximité
- La méthode du double-hybride
- La méthode de complémentation des protéines
17
Q
Quelle méthode permet d’identifier des interactions ADN-protéine in vivo ?
A
Le ChIP (Chromatin Immunoprecipitation).
18
Q
Quelle méthode est utilisée pour identifier les interactions ARN-protéine in vivo ?
A
Le CLIP (Cross-Linking and Immunoprecipitation).
19
Q
Quelles sont les étapes de la co-immunoprécipitation pour détecter une interaction ?
A
- Lyse cellulaire à l’aide d’un détergent
- Sélection d’une protéine connue à l’aide d’un anticorps fixé sur un support solide
- Précipitation des complexes formés pour analyse
20
Q
Comment fonctionne l’électrophorèse sur gel d’acrylamide avec SDS ?
A
Le SDS dénature les protéines et leur confère une charge négative proportionnelle à leur taille, permettant leur séparation par poids moléculaire sur gel de polyacrylamide.
21
Q
Comment fonctionne le Western blot (immunobuvardage) ?
A
Le Western blot sépare les protéines selon leur taille par électrophorèse sur gel SDS-PAGE, puis les transfère sur une membrane. Un anticorps spécifique est utilisé pour détecter la protéine d’intérêt sur cette membrane.
22
Q
Quel est le lien entre la co-immunoprécipitation et le Western blot ?
A
La co-immunoprécipitation sélectionne une protéine par son anticorps, ainsi que ses partenaires de liaison. Le Western blot permet ensuite de détecter spécifiquement des protéines dans le complexe à l’aide d’anticorps.
23
Q
Quelle est la principale limite de la co-immunoprécipitation ?
A
La co-immunoprécipitation ne permet pas de déterminer si l’interaction entre deux protéines est directe ou indirecte.
24
Q
Quelles conditions sont nécessaires pour démontrer une interaction par co-IP et Western blot ?
A
- Avoir une hypothèse sur l’identité des protéines A et B.
- Disposer d’anticorps anti-A et anti-B qui n’interfèrent pas avec l’interaction (épitope disponible).
- L’interaction doit être stable en présence du détergent utilisé pour la lyse.
25
Quels sont les avantages de la co-immunoprécipitation combinée au Western blot ?
- Permet de démontrer des interactions entre protéines endogènes.
- Reflète les interactions ayant lieu dans une cellule vivante.
26
Quels sont les inconvénients de la co-IP avec Western blot ?
- Les anticorps spécifiques peuvent être coûteux ou difficiles à générer.
- L’interaction détectée peut ne pas être directe.
- Certaines interactions peuvent être détruites lors de la lyse.
- Le processus de lyse peut créer de faux positifs.
27
Quel problème majeur peut survenir avec la co-IP utilisant des protéines endogènes ?
La génération d’un anticorps spécifique pour la protéine cible peut être difficile, ce qui limite l’efficacité de la co-IP.
28
Comment améliorer la co-IP avec des protéines fusionnées à une étiquette ?
Il est possible de créer des protéines fusion avec une étiquette (ex. GST, FLAG-tag, TAP-tag) ajoutée à l’extrémité N- ou C-terminale.
29
Quels sont les avantages de l’utilisation d’étiquettes dans la co-IP ?
- Réutilisation du même anticorps ou ligand.
- Double étiquetage (TAP-tag) permet une double purification, réduisant les faux positifs.
30
Quels sont les inconvénients de l’utilisation d’étiquettes dans la co-IP ?
- L’étiquette peut masquer un site de liaison ou créer un site artificiel (faux négatif/positif).
- L’expression se fait à partir de vecteurs, donc les niveaux endogènes peuvent être altérés.
31
Pourquoi la détection d’une protéine co-IP par un autre anticorps peut-elle être problématique ?
Elle représente un inconvénient majeur car elle nécessite des anticorps compatibles qui ne perturbent pas l’interaction et qui peuvent différencier la protéine précipitée.
32
Comment adapter la détection des protéines co-immunoprécipitées pour le criblage à haut débit ?
En combinant la co-IP avec la spectrométrie de masse, on peut identifier efficacement les partenaires d’interaction à grande échelle.
33
Quelles sont les étapes d’analyse par spectrométrie de masse ?
1. Purification par affinité.
2. Gel SDS-PAGE (1D ou 2D), découpe du gel.
3. Digestion par trypsine.
4. Analyse LC-MS/MS : chromatographie liquide + spectrométrie de masse en tandem.
34
Que permet la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) ?
Elle permet le séquençage de petits peptides (10–20 acides aminés), facilitant l’identification des protéines co-immunoprécipitées.
34
Comment les fragments peptidiques identifiés par spectrométrie de masse sont-ils analysés ?
Les séquences sont comparées à des bases de données pour identifier les protéines à partir desquelles les peptides proviennent.
35
Quels sont les avantages de la spectrométrie de masse pour identifier les protéines co-IP ?
- Criblage à haut débit.
- Identification directe possible si le génome est séquencé.
36
Quels sont les inconvénients de la spectrométrie de masse dans la détection des protéines co-IP ?
- Faux positifs possibles.
- Certains peptides ne sont pas détectables (hydrophobes).
- Reproductibilité nécessaire.
- Interprétation des données complexes.
37
Qu’est-ce que ChIP (immunoprécipitation de la chromatine) ?
C’est une variante de la co-IP utilisée pour identifier les interactions ADN-protéine dans la chromatine.
38
Que détecte-t-on avec un ChIP ?
Des fragments d’ADN enrichis liés à une protéine particulière.
39
Comment identifie-t-on les fragments d’ADN dans une expérience de ChIP ?
Par séquençage à haut débit (ChIP-seq), qui permet d’identifier précisément les régions d’ADN liées à une protéine.
40
Que permet d’identifier le RIP et le CLIP dans l’étude des interactions ARN-protéine ?
Le RIP et le CLIP utilisent des anticorps pour isoler des complexes ribonucléoprotéiques. Ces techniques sont combinées au séquençage à haut débit (RIP-Seq, HITS-CLIP/CLIP-Seq) pour identifier les ARN liés à des protéines.
41
Qu’est-ce que le RIP (RNA-Immunoprecipitation) ?
Le RIP est une méthode d’immunoprécipitation d’ARN utilisant un crosslink chimique pour stabiliser les interactions ARN-protéine avant la purification.
42
Le RIP est une méthode d’immunoprécipitation d’ARN utilisant un crosslink chimique pour stabiliser les interactions ARN-protéine avant la purification.
Le nRIP (RIP natif) s’effectue sans crosslink. Il évite les artéfacts de crosslink mais peut générer de nombreux faux positifs en raison d’artéfacts de réassociation.
43
Qu’est-ce que le CLIP dans l’étude des interactions ARN-protéine ?
Le CLIP (UV-crosslinked immunoprecipitation) utilise un crosslink par rayons UV pour stabiliser les interactions ARN-protéine avant l’analyse.
44
En quoi consiste la méthode PAR-CLIP ?
Le PAR-CLIP est une variante du CLIP qui utilise des ribonucléosides photoactivables pour améliorer l’efficacité du crosslink et permettre une identification précise du site de liaison ARN-protéine, réduisant potentiellement les faux positifs.
45
Quel est le principe de l’essai de marquage par proximité ?
L’essai repose sur la proximité d’une protéine avec ses partenaires : une enzyme fusionnée à la protéine d’intérêt marque les protéines proches.
46
Quelles enzymes sont utilisées dans l’essai de marquage par proximité ?
Des enzymes comme la péroxidase ou une biotine ligase sont fusionnées à la protéine d’intérêt pour marquer les protéines voisines.
47
Quel est le rôle des enzymes dans l’essai de marquage par proximité ?
Elles ajoutent de la biotine aux protéines ou acides nucléiques proches de la protéine d’intérêt.
48
Comment les protéines marquées par proximité sont-elles analysées ?
Elles sont enrichies via une résine et analysées par spectrométrie de masse (MS), souvent en présence d’un contrôle négatif appelé « référence spatiale ».
49
Quelle est l’utilité de la streptavidine dans le marquage par proximité ?
La streptavidine est une protéine tétramérique avec une affinité très forte pour la biotine (Kd ≈ 10 fM), utilisée pour purifier les protéines marquées.
50
Comment la streptavidine est-elle utilisée pour purifier les protéines marquées ?
Un support solide conjugué à la streptavidine permet de capturer les protéines biotinylées pour leur purification.
51
Quels sont les avantages du marquage par proximité ?
- Permet d’identifier les protéines proches avant la lyse, évitant les artéfacts.
- Permet d’inférer la localisation cellulaire de la protéine d’intérêt.
52
Quels sont les inconvénients du marquage par proximité ?
- Ne prouve pas l’interaction directe entre protéines.
- La fusion peut créer des faux positifs/négatifs.
- L’expression exogène de la protéine fusion peut fausser la localisation.
53
Comment fonctionne le concept du double hybride ?
Deux domaines d’un activateur transcriptionnel (DBD et AD) sont fusionnés à deux protéines différentes (appât et proie). Si elles interagissent, un gène rapporteur est exprimé dans une levure trp-, leu-, his-.
54
Quels sont les deux types de gènes rapporteurs utilisés dans le double hybride ?
HIS : sélection par croissance sur milieu sans histidine.
lacZ : production de β-galactosidase mesurable par coloration.
55
Comment construit-on la protéine « appât » dans le système double hybride ?
La protéine cible est fusionnée au DBD (DNA-binding domain) d’un activateur transcriptionnel.
56
Comment construit-on la protéine « proie » dans le système double hybride ?
Des fragments de protéines (ou une banque d’ADNc) sont fusionnés au AD (activator domain) pour détecter les partenaires qui interagissent avec la protéine cible.
57
Comment les protéines recombinantes du double hybride sont-elles testées ?
Elles sont introduites dans des levures, et si interaction il y a, l’activation transcriptionnelle du gène rapporteur permet la croissance.
58
Que permet de détecter le système double hybride dans la levure ?
La croissance des colonies indique une interaction entre les deux protéines hybrides, car elle entraîne l’activation transcriptionnelle du gène rapporteur.
59
Quels sont les avantages du système double hybride ?
- Détecte des interactions directes.
- Pas besoin d’hypothèse : permet de tester des banques d’ADNc.
- Peut aussi tester une interaction ciblée.
- S’adapte bien au criblage à haut débit.
60
Quels sont les inconvénients du système du double hybride ?
- Haut taux de faux positifs : le système est artificiel et dépend de la surexpression dans le noyau de la levure.
- Les protéines détectées peuvent ne pas être exprimées dans le même type cellulaire ou à des concentrations normales.
- On ne peut pas conclure à une absence d’interaction : risque de faux négatifs.
61
Quelle est une caractéristique clé du PCA concernant le méthotrexate ?
Dans la méthode de complémentation de fragments protéiques (PCA), le méthotrexate inhibe l’enzyme endogène de la cellule, mais pas l’enzyme complémentée artificiellement si les fragments se rejoignent suite à une interaction.
62
Quelle réaction catalyse l’enzyme dihydrofolate réductase utilisée en PCA ?
La dihydrofolate réductase transforme l’acide dihydrofolique en acide tétrahydrofolique, essentiel à la survie cellulaire.
63
Pourquoi l’acide tétrahydrofolique est-il important dans la méthode PCA ?
Il est essentiel au métabolisme des acides aminés et des nucléotides, permettant la croissance cellulaire si l’interaction protéique active la dihydrofolate réductase.
64
Que permet de détecter le PCA au niveau des protéines ?
Le PCA permet la détection d’interactions entre protéines à des niveaux d’expression endogènes, dans leur compartiment cellulaire naturel.
65
Comment interpréter les résultats d’un essai PCA ?
Pas d’interaction : pas de croissance après ajout de méthotrexate.
Interaction présente : croissance cellulaire observée malgré le méthotrexate.
66
Quels sont les avantages de la méthode PCA ?
- Étude des interactions in vivo, avec expression endogène.
- Très sensible (≈ 25 molécules/cellule).
- Applicable à divers types cellulaires (levure, cellules de mammifères).
- Adaptée au criblage à haut débit, identification de cibles thérapeutiques, visualisation de complexes.
67
Quels sont les inconvénients du PCA ?
- Tendance à l’auto-assemblage des fragments protéiques.
- Les protéines de fusion peuvent masquer ou créer des sites de liaison, causant des faux positifs ou négatifs.
68
Qu’est-ce que l’interactome, et à quoi sert-il ?
L’interactome est une carte des interactions protéine-protéine dans la cellule. Il aide à prédire la fonction d’une protéine inconnue à partir de ses partenaires d’interaction.
69
Quelle est la définition de l’interactome ?
L’interactome est l’ensemble des interactions moléculaires dans une cellule, incluant notamment les interactions protéine-protéine.
70
Quelles méthodes permettent la quantification des interactions in vitro ?
- Résonance plasmonique de surface (SPR)
- Calorimétrie à titrage isotherme (ITC)
- Retard sur gel
71
Comment vérifier une interaction directe entre deux macromolécules ?
En réalisant des expériences in vitro avec des molécules purifiées, afin d’évaluer affinité et spécificité.
72
Quelle est l’équation de l’énergie libre de liaison ?
ΔG = RTlnKd = ΔH − TΔS
avec 𝑅 = 1,987 cal/Kmol et 𝑇 en Kelvin (K).
73
Comment est définie l’affinité entre deux molécules ?
L’affinité est la force de l’interaction non-covalente, mesurée par le Ka ou le Kd. Une forte affinité correspond à un Ka élevé et un Kd faible.
74
Que signifie la spécificité d’une interaction moléculaire ?
La spécificité est la capacité d’une molécule (ex. une protéine) à se lier préférentiellement à un ligand plutôt qu’à d’autres molécules.
75
Comment étudie-t-on la spécificité d’une interaction ?
En mesurant l’affinité de liaison de différents ligands pour identifier les déterminants de la spécificité.
76
Donne un exemple d’analyse de spécificité moléculaire.
La protéine X lie l’ADN double brin avec une affinité 𝐾𝑑 = 2 𝑛𝑀, et l’ADN simple brin avec 𝐾𝑑 > 2 µ𝑀.
On en conclut que la protéine X est spécifique à l’ADN double brin.
77
Qu’est-ce que la SPR (Surface Plasmon Resonance) ?
C’est une méthode biophysique permettant de suivre en temps réel les interactions entre biomolécules à l’aide d’une molécule fixée sur une surface (biocapteur).
78
Que permet de visualiser la SPR ?
La SPR visualise en temps réel les interactions entre biomolécules non marquées, dans un flux continu de tampon.
79
Quel est le principe de la SPR pour détecter une interaction ?
Un ligand est fixé sur une puce capteur (sensor chip). L’analyte, dilué dans un tampon, circule sur la surface à débit constant.
L’interaction est détectée en temps réel.
80
Comment la résonance plasmonique de surface (SPR) détecte-t-elle les interactions moléculaires ?
L’association ou la dissociation des complexes modifie la réfringence du milieu, ce qui décale l’angle de résonance de la lumière réfléchie, permettant ainsi de détecter les interactions.
81
Que permet d’enregistrer un sensorgramme en SPR ?
Le sensorgramme enregistre en temps réel la variation de l’angle de résonance, exprimée en unités de résonance (RU). Il permet d’extraire :
- kass : vitesse d’association
- kdiss : vitesse de dissociation
Et de calculer :
- Ka = kass / kdiss
- Kd = kdiss / kass
82
Quels sont les avantages de la SPR ?
- Étude en temps réel
- Compatible avec un grand nombre de molécules (protéines, acides nucléiques, lipides…)
- Permet l’étude d’interactions multiples
- Fournit des données cinétiques (kass, kdiss) et thermodynamiques (KD de 10⁻⁴ à 10⁻¹² M)
- Ne nécessite pas de marquage
83
Quels sont les inconvénients de la SPR ?
- L’immobilisation de la molécule sur la surface peut altérer son activité
- Ne permet pas d’évaluer l’homogénéité de l’échantillon
84
Qu’est-ce que la calorimétrie à titrage isotherme (ITC) ?
C’est une méthode biophysique permettant de mesurer la chaleur générée ou absorbée lors d’une interaction moléculaire, directement en solution.
85
Comment se déroule une expérience typique d’ITC ?
On injecte progressivement une solution de ligand dans une cellule contenant le partenaire de liaison, ce qui produit ou absorbe de la chaleur à chaque injection.
86
Que mesure le système dans une expérience ITC ?
Il mesure et compense la différence de chaleur (ΔT₁) entre la cellule expérimentale et une cellule de référence.
87
Quelle est la donnée brute d’une expérience ITC ?
La puissance (µcal/sec) nécessaire pour maintenir ΔT₁ constant après chaque injection constitue la donnée brute.
88
Que permet de tracer la courbe de liaison isotherme en ITC ?
L’intégrale de la puissance mesurée permet de calculer la chaleur générée (kcal/mol), représentée en fonction du rapport molaire ligand/partenaire.
89
Quels paramètres peut-on obtenir à partir d’une expérience ITC ?
On peut déterminer :
- ΔH (enthalpie)
- KD (constante de dissociation)
- ΔG (énergie libre)
- ΔS (entropie)
- n (stœchiométrie)
90
Quels sont les avantages de l’ITC ?
- Permet d’obtenir tous les paramètres thermodynamiques en une seule expérience
- Mesure directe de KD entre 10⁻² et 10⁻⁹ M
- Méthode sans marquage, réalisée en solution
91
Quels sont les inconvénients de l’ITC ?
- Impossible si ΔH est faible ou nul
- Demande parfois beaucoup de matériel
- Ne donne pas d’info sur l’homogénéité de l’échantillon
92
Qu’est-ce que le retard sur gel (gel shift) ?
C’est une méthode basée sur une électrophorèse sur gel natif permettant d’étudier les interactions ARN/protéine ou ADN/protéine.
93
Que permet de détecter le retard sur gel ?
Il permet de savoir si une protéine interagit avec une séquence spécifique d’acide nucléique, en observant un décalage de migration.
94
Que peut révéler un super-retard en gel ?
Un super-retard indique que plusieurs protéines interagissent avec la même molécule d’acide nucléique.
95
Comment déterminer le KD avec un gel shift ?
La concentration d’ARN est constante et très faible (1 pM).
La radioactivité est idéale détecter de faibles quantités d’ARN.
La concentration de protéine varie de 0,02 à 50 nM.
96
Comment déterminer la stœchiométrie avec un gel shift ?
On utilise des concentrations croissantes de protéines
On observe différents ratios ARN:protéine
97
Que signifient les différents types de retard en gel ?
- Retard : interaction 1:1
- Super-retard : interaction 1:2
- Super-super-retard : interaction 1:3
98
Quels sont les avantages du retard sur gel ?
- Simple, peu coûteux
- Requiert peu de matériel
- Donne directement KD (10⁻⁶ - 10⁻¹⁰ M)
- Permet de visualiser la stœchiométrie et les différents complexes
99
