Cours 10 - RMN des protéines

Question 1

Quelle est la composition d’un atome ?

Answer 1

Un atome est constitué d’un noyau central, composé de neutrons (charge neutre) et de protons (charge positive), entouré d’électrons en orbite autour du noyau.

Question 2

Quelle est l’origine de la RMN et quelle est la formule du moment angulaire nucléaire ?

Answer 2

La RMN résulte du moment angulaire du spin nucléaire (P), donné par la formule :

P = h * sqrt[I(I + 1)], où I est le spin nucléaire et h est la constante de Planck divisée par 2π.

Question 2

Qu’est-ce que l’effet NOE en RMN et que mesure-t-il ?

Answer 2

L’effet NOE (Nuclear Overhauser Effect) reflète l’influence des noyaux proches dans l’espace. Il informe sur leur distance (< 5 Å), indépendamment des liaisons covalentes.

Question 2

Quelles sont les valeurs possibles du spin nucléaire (I) selon les caractéristiques nucléaires ?

Answer 2

I = 0 : si le nombre de masse (A) et le numéro atomique (Z) sont pairs

I = entiers × 1/2 : si A est impair

I = entiers : si A est pair et Z est impair

Question 3

Quels types de noyaux observe-t-on en RMN selon leur spin nucléaire ?

Answer 3

I = 0 : noyaux inactifs

I > 1/2 : noyaux avec moment quadrupolaire, relaxation rapide, difficiles à étudier

I = 1/2 : noyaux actifs, comme ¹H, ¹³C, ¹⁵N et ³¹P

Question 4

Que reflète le déplacement chimique (δ) en RMN ?

Answer 4

Le déplacement chimique (δ) reflète l’environnement électronique d’un noyau, influençant sa fréquence de résonance.

Question 5

Qu’est-ce que le couplage scalaire (J) en RMN et que permet-il d’étudier ?

Answer 5

Le couplage scalaire (J) est un effet des noyaux proches dans la structure covalente. Il fournit des informations sur les angles de torsion entre liaisons.

Question 5

Pourquoi les noyaux ne ressentent-ils pas directement le champ B₀ ?

Answer 5

Le champ local B₀ᵢ est modifié par la structure électronique :

B₀ᵢ = B₀ * (1 - σᵢ), où σᵢ est la constante de blindage.

Question 6

Qu’est-ce que la fréquence de Larmor ?

Answer 6

La fréquence de Larmor correspond à la vitesse angulaire à laquelle un moment magnétique nucléaire (comme celui d’un proton) précesse autour d’un champ magnétique externe.

Au lieu de s’aligner directement avec B0, le noyau fait un mouvement de précession : il tourne autour de la direction du champ, comme une toupie autour d’un axe vertical.

Question 7

De quoi dépend la constante de blindage (σi) et qu’influence-t-elle ?

Answer 7

Elle dépend de la densité électronique autour du noyau et des groupements fonctionnels voisins. Elle ne dépend pas de la force du champ magnétique B₀.

Question 8

Où se situent les déplacements chimiques des protons (¹H) dans les protéines ?

Answer 8

Les protons déblindés (moins protégés électroniquement) apparaissent à bas champ (à gauche du spectre), avec des déplacements chimiques plus grands.

Question 8

Pourquoi les variations de fréquence (Δω) sont-elles petites en RMN ?

Answer 8

Parce que les constantes de blindage (σi) sont très petites, donc ωᵢ ≈ ω₀ + Δω, avec Δω très faible.

Question 8

Pourquoi différents noyaux ont-ils des vitesses angulaires (ωi) différentes ?

Answer 8

Car chaque noyau a une constante de blindage (σi) propre, influençant son champ local (Boi) et donc sa fréquence de précession :

ωᵢ = -γ * B₀ * (1 - σᵢ)

Question 9

Quel est l’inconvénient majeur de l’observation des fréquences de résonance en RMN ?

Answer 9

Les fréquences dépendent directement du champ magnétique B₀, ce qui complique les comparaisons entre instruments.

Question 9

Quelle est l’ampleur typique d’un déplacement chimique pour le proton (¹H) à 500 MHz ?

Answer 9

À B₀ = 11.7 T, la variation Δω du ¹H est d’environ 7500 Hz, ce qui est petit par rapport à la fréquence totale.

Question 9

Comment calcule-t-on le déplacement chimique (δ) en RMN ?

Answer 9

δ = ((ν - ν_ref) / ν_ref) * 10⁶, exprimé en ppm, avec ν la fréquence du noyau et νref celle du standard.

Question 9

Où se trouvent les protons blindés dans un spectre RMN du ¹H en protéines ?

Answer 9

Les protons blindés, c’est-à-dire bien protégés électroniquement, apparaissent à haut champ (à droite du spectre), avec un petit déplacement chimique.

Question 9

Quels facteurs influencent le déplacement chimique du ¹H dans les protéines ?

Answer 9

Le déplacement chimique dépend :

1. de la nature des groupements chimiques associés au proton,
2. du repliement de la protéine en solution.

Question 10

Quel est l’avantage majeur de l’observation des fréquences de résonance ν en RMN ?

Answer 10

Chaque noyau a une fréquence de résonance unique, ce qui rend la RMN très spécifique et informative.

Question 11

Comment compense-t-on la dépendance de ν au champ B₀ en RMN ?

Answer 11

On utilise le déplacement chimique (δ), exprimé en ppm, ce qui permet une mesure indépendante de B₀.

Question 12

Quels noyaux sont les plus utilisés en RMN ?

Answer 12

Les noyaux les plus utilisés sont : ¹H, ¹³C, ¹⁵N, ¹⁹F et ³¹P, tous ayant I = 1/2 et donc actifs en RMN.

Question 12

Que représente chaque acide aminé dans un spectre TOCSY ?

Answer 12

Chaque acide aminé constitue un ou plusieurs systèmes de spins indépendants, chacun avec ses corrélations internes.

Question 12

Quel composé est utilisé comme référence pour le déplacement chimique (δ) ?

Answer 12

Le Tétraméthylsilane (TMS) est le standard, avec un déplacement chimique de δ = 0 ppm.

Question 13

Quel est l’ordre des groupes chimiques dans un spectre RMN du ¹H en protéines (de droite à gauche) ? (PAS IMPO)

Answer 13

L’ordre croissant du déplacement chimique est : méthyl < aliphatique < alpha < HN chaîne latérale < aromatique < HN chaîne principale.

Question 13

Comment le déplacement chimique du ¹³C permet-il d’identifier les acides aminés ?

Answer 13

Chaque acide aminé a une distribution spécifique de déplacements chimiques ¹³C, ce qui permet d’identifier facilement le type d’acide aminé.

Question 13

Quelle est la concentration typique d’un échantillon pour une étude RMN de protéine ?

Answer 13

Typiquement, on utilise 1 mM dans 250–500 µL, ce qui représente 3–5 mg d’une protéine de 100 résidus.

Question 13

Qu’est-ce que le couplage scalaire homonucléaire J et que permet-il d’obtenir ?

Answer 13

C’est un effet entre protons proches dans la structure covalente, séparés par ≤ 3 liaisons. Il est lié à l’angle de torsion via la relation de Karplus : ³JAB = C₁ + C₂ * cos(θ) + C₃ * cos(2θ), ce qui donne des contraintes angulaires.

Question 13

Quelles expériences RMN 2D homonucléaire sont utilisées pour l’attribution des résonances ?

Answer 13

Deux expériences principales sont utilisées : - 2D COSY (Correlated Spectroscopy) - 2D TOCSY (Total Correlated Spectroscopy) Ces expériences reposent sur le couplage scalaire (J).

Question 13

Qu’est-ce que l’effet NOE et quelle information fournit-il ?

Answer 13

L’effet NOE (Nuclear Overhauser Effect) est un phénomène entre protons proches dans l’espace, fournissant des contraintes de distance (r), utiles en détermination de structure.

Question 13

À quoi servent les échanges proton-deutérium en RMN ?

Answer 13

En remplaçant H₂O par D₂O, certains protons labiles échangent avec le deutérium, ce qui simplifie les spectres RMN.

Question 14

Quels protons sont remplacés lors des échanges H/D en solution D₂O ?

Answer 14

Les protons des groupes fonctionnels suivants peuvent être remplacés par du deutérium : >NH, >COOH, >NH₂, >NH₃, >OH, >SH.

Question 14

Quelles sont les étapes de la détermination structurale par RMN ?

Answer 14

Les étapes sont : 1. Purification et marquage des protéines 2. Attribution des déplacements chimiques 3. Collecte des contraintes structurales 4. Calcul des structures, corrélées aux fonctions biologiques

Question 14

Quel est le rôle du spectre 2D COSY en RMN ?

Answer 14

Le spectre COSY est l’expérience standard pour détecter les corrélations de couplage scalaire J entre protons.

Question 14

Comment les signaux du spectre 2D COSY sont-ils convertis ?

Answer 14

Les signaux détectés pendant t₁ et t₂ sont transformés en fréquences via deux transformées de Fourier : S(t1,t2) → S(t1,F2) → S(F1,F2)

Question 14

Comment identifie-t-on les acides aminés à partir des spectres COSY et TOCSY ?

Answer 14

Chaque acide aminé produit un patron de signaux caractéristiques dans les spectres COSY et TOCSY, facilitant leur identification.

Question 14

Qu’est-ce qui distingue le spectre TOCSY du spectre COSY ?

Answer 14

Dans TOCSY, chaque ¹H d’un système de spins est corrélé à tous les autres ¹H du même système par couplage scalaire J.

Question 14

Quand observe-t-on un transfert de magnétisation dans un spectre 2D COSY ?

Answer 14

Il y a transfert de magnétisation entre deux protons A et B lorsqu’ils sont séparés par 2 ou 3 liaisons chimiques (Jₐb ≠ 0).

Question 14

Où se trouvent les signaux d’intérêt dans un spectre 2D COSY ?

Answer 14

Les signaux pertinents sont symétriques de chaque côté de la diagonale principale du spectre.

Question 15

Quelles sont les limites de la RMN homonucléaire ?

Answer 15

1. Le transfert de magnétisation par couplage scalaire J (COSY/TOCSY) est inefficace pour les petites valeurs de J 2. Les signaux se recouvrent dans les spectres 3. Cette méthode est limitée aux petites protéines (< 100 résidus)

Question 15

Comment sont disposés les signaux dans un spectre TOCSY ?

Answer 15

Les signaux d’intérêt dans un spectre TOCSY sont disposés symétriquement de part et d’autre de la diagonale, comme dans COSY.

Question 15

Quelle expérience RMN est standard pour étudier les corrélations NOE ?

Answer 15

Le spectre NOESY (NOE Spectroscopy) est l’expérience standard pour étudier les corrélations entre protons proches dans l’espace.

Question 15

Quel impact ont les NOEs sur la conformation de la chaîne peptidique ?

Answer 15

Lorsqu’ils relient des protons éloignés dans la séquence primaire, les NOEs restreignent fortement la conformation globale de la chaîne.

Question 15

Comment utilise-t-on l’intensité des NOEs pour calculer une structure ?

Answer 15

L’intensité est convertie en contrainte de distance, utilisée dans les calculs de structure 3D de la protéine.

Question 16

Comment produit-on des protéines marquées pour la RMN hétéronucléaire ?

Answer 16

Les protéines marquées en ¹⁵N ou ¹³C–¹⁵N sont produites par expression recombinante (bactéries ou levures), permettant l’étude par RMN multidimensionnelle.

Question 16

Dans quelles conditions observe-t-on un transfert de magnétisation dans le spectre NOESY ?

Answer 16

Il y a transfert de magnétisation entre deux protons A et B s’ils sont proches dans l’espace (r ≤ 5,0 Å), indépendamment de leur liaison covalente.

Question 16

Quelles sont les caractéristiques des milieux de culture pour produire des protéines marquées ?

Answer 16

Ils contiennent comme seules sources d’azote et de carbone : NH₄Cl marqué en ¹⁵N et glucose marqué en ¹³C.

Question 16

Quels acides aminés peuvent présenter des patrons RMN identiques en spectres COSY/TOCSY ?

Answer 16

Certains acides aminés ont des systèmes de spin identiques, produisant des patrons similaires : - Cys et Asp - Glu, Gln et Met

Question 16

Comment la RMN hétéronucléaire améliore-t-elle la résolution des spectres ?

Answer 16

Grâce aux corrélations hétéronucléaires et aux spectres multidimensionnels (3D, 4D), elle améliore fortement la résolution des signaux.

Question 16

Quelles contraintes doivent être satisfaites lors du calcul d’un ensemble de structures RMN ?

Answer 16

Les structures doivent respecter : 1.Les contraintes RMN (NOE, J, etc.) 2. La structure covalente de la protéine 3. D’autres contraintes : Van der Waals, électrostatiques, etc.

Question 17

Quels sont les avantages de la RMN hétéronucléaire ?

Answer 17

1. Transfert de magnétisation J plus efficace 2. Meilleure résolution grâce aux corrélations hétéronucléaires 3. Permet l’étude de protéines plus grandes

Question 17

Quels types de spectres RMN sont utilisés pour l’attribution des résonances en RMN hétéronucléaire ?

Answer 17

Des spectres 2D, 3D et 4D corrélant plusieurs noyaux (¹H, ¹³C et ¹⁵N) sont utilisés pour l’attribution précise des résonances.

Question 18

Que sont les NOEs en RMN structurale ?

Answer 18

Les NOEs sont des interactions entre protons proches dans l’espace (r ≤ 5,0 Å) qui reflètent les conformations moléculaires.

Question 18

De quoi dépend l’intensité des signaux dans un spectre NOESY ?

Answer 18

L’intensité est proportionnelle à la distance inter-résidu, permettant une estimation qualitative des distances entre protons.

Question 18

Quelle relation existe entre les angles phi et le couplage ³JNHα ?

Answer 18

Il existe une corrélation forte entre l’angle φ (phi) et la valeur du couplage ³JNHα, utile pour identifier les éléments secondaires.

Question 18

Quels patrons de NOE observe-t-on dans les hélices α et les feuillets β ?

Answer 18

Ces éléments de structure secondaire présentent des patrons distincts de NOE : hélices α montrent des NOEs i→i+3/i+4, tandis que les feuillets β montrent des NOEs entre brins adjacents.

Question 18

Quelles classes de contraintes de distance peut-on déduire des intensités NOE ?

Answer 18

On distingue 4 classes : - Très intense : 1,8–2,7 Å - Moyenne : 1,8–3,3 Å - Faible : 1,8–5,0 Å - Très faible : 3,0–6,0 Å

Question 18

Quels critères permettent de valider une structure calculée par RMN ?

Answer 18

Les structures acceptées présentent une énergie basse et peu de violations des contraintes expérimentales.

Question 18

Qu’est-ce que le diagramme de Ramachandran ?

Answer 18

C’est un graphique qui représente la conformation du squelette des protéines en fonction des angles dièdres φ et Ψ pour chaque acide aminé.

Question 18

Quels sont les avantages de la RMN pour la détermination de la structure des protéines ?

Answer 18

1. Méthode réalisée à l’état liquide 2. Très utile pour les petites protéines non cristallisables 3. Permet d’étudier le repliement des protéines et de cartographier les sites de liaison par changement de déplacements chimiques 4. Fournit des informations sur la dynamique des protéines

Question 18

Comment représente-t-on les structures acceptées par RMN ?

Answer 18

Elles sont superposées pour minimiser la RMSD (root-mean-square deviation) des atomes lourds, ce qui définit la précision du modèle.

Question 18

Quel critère de qualité utilise-t-on avec le diagramme de Ramachandran pour valider un ensemble de structures protéiques ?

Answer 18

Un bon ensemble de structures doit contenir au moins 90 % des acides aminés dans les zones favorables du diagramme de Ramachandran, correspondant aux conformations stables des angles φ et Ψ.

Question 18

Quelles régions favorables identifie-t-on dans le diagramme de Ramachandran ?

Answer 18

Trois zones sont particulièrement favorables, correspondant aux structures secondaires : hélices α, feuillets β et hélices gauches.

Question 18

Quelles sont les limites de la RMN pour la détermination structurale des protéines ?

Answer 18

1. Limitée aux petites protéines (< 30–40 kDa) 2. Nécessite une grande quantité de protéine purifiée 3. Ne permet pas de localiser précisément les molécules d’eau ni les ions métalliques

Question 18

Quelle est l’utilité de l’expérience ¹H-¹⁵N HSQC en RMN des protéines ?

Answer 18

L’expérience ¹H–¹⁵N HSQC établit une corrélation entre le proton amide (¹H) et l’azote (¹⁵N) du même groupe amide, fournissant un spectre sensible et résolu des résidus d'une protéine.

Question 18

Quelle information obtient-on pour chaque acide aminé dans un spectre ¹H–¹⁵N HSQC ?

Answer 18

Chaque acide aminé, sauf la proline (qui n’a pas de proton amide), donne un pic de corrélation entre le ¹H et le ¹⁵N de son groupe amide.

Question 18

Comment le spectre ¹H–¹⁵N HSQC est-il utilisé en découverte de médicaments ?

Answer 18

Il permet la cartographie des sites de liaison sur les protéines : en suivant les changements de déplacement chimique, on identifie les résidus impliqués dans la liaison d’un ligand.

Question 18

Qu’est-ce que la CSP en RMN et à quoi sert-elle ?

Answer 18

La CSP (Chemical Shift Perturbation ou Perturbation de Déplacement Chimique) mesure les changements de position des signaux dans un spectre RMN, permettant de cartographier les interactions entre une protéine et un ligand.

Question 18

Pourquoi la glutamine (Q) et l’asparagine (N) donnent-elles deux signaux dans le ¹H–¹⁵N HSQC ?

Answer 18

Leurs chaînes latérales comportent un groupe amide (–CONH₂) avec deux protons liés à un même azote, ce qui donne deux signaux distincts dans le spectre.

Question 18

Pourquoi les groupes NH₂/NH₃⁺ de la lysine et de l’arginine ne sont-ils pas visibles dans le spectre ¹H–¹⁵N HSQC ?

Answer 18

Les protons des groupes NH₂ et NH₃⁺ échangent trop rapidement avec le solvant, rendant leurs signaux invisibles dans le spectre HSQC.

Question 18

Que se passe-t-il dans un spectre HSQC lorsqu’un ligand se lie à une protéine ?

Answer 18

Seuls les groupes amides (>NH) proches du site de liaison montrent des changements de déplacement chimique. Si la structure de la protéine est connue, cela permet d’identifier le site de liaison.