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Cours 13 - Cryo-ME des protéines Flashcards

1
Q

Quand et comment a été développée la microscopie électronique (ME) ?

A

La microscopie électronique (ME) est une technique dont les fondements théoriques datent du XIXe siècle.

Le premier microscope électronique a été développé dans les années 1930, ce qui en fait une méthode ancienne mais continuellement améliorée.

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2
Q

Qu’est-ce que la “révolution de la résolution” en microscopie électronique ?

A

La “révolution de la résolution” a eu lieu autour des années 2000. Avant, les microscopes électroniques ne permettaient de voir que des “blobs” sans structure définie.

Aujourd’hui, ils permettent d’identifier des structures précises jusqu’aux acides aminés et atomes.

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3
Q

Quelles sont les similitudes entre un microscope optique et un microscope électronique ?

A

Les deux utilisent un système en cinq parties :

  1. Une source de rayons (lumière ou électrons)
  2. Un condenseur
  3. Un spécimen
  4. Un objectif
  5. un détecteur
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3
Q

Quelles sont deux exigences techniques pour le fonctionnement d’un microscope électronique ?

A

Les microscopes électroniques nécessitent un voltage élevé pour accélérer les électrons et un environnement sous vide pour éviter leur déviation par des molécules d’air.

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4
Q

Comment les électrons interagissent-ils avec l’échantillon en microscopie électronique ?

A

Les électrons ne sont pas absorbés, mais diffusés par l’échantillon, ce qui crée des différences de phase entre les ondes électroniques.

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4
Q

Pourquoi les détecteurs en microscopie électronique ne détectent-ils pas les différences de phase ?

A

Les détecteurs “comptent” les électrons individuellement, mais ne peuvent pas distinguer les différences de phase entre deux électrons.

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5
Q

Qu’est-ce que l’interférence des électrons diffusés dans un échantillon cause dans une image ME ?

A

Elle génère du contraste de phase, avec des régions de contraste positif ou négatif, ce qui permet de visualiser les structures.

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6
Q

Comment le contraste varie-t-il avec le focus dans une image de microscopie électronique ?

A

Il y a peu de contraste quand l’image est en focus, mais celui-ci augmente lorsqu’on applique un défocus.

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7
Q

Qu’est-ce que la transformation de Fourier en microscopie électronique ?

A

C’est une opération mathématique qui transforme un signal en espace réel (comme une image) en ses composantes fréquentielles, représentant l’image dans l’espace de Fourier.

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8
Q

Quelle est la relation entre espace réel et espace de Fourier en microscopie ?

A

L’espace réel montre l’image brute, tandis que l’espace de Fourier présente la décomposition en fréquences du signal d’origine, utile pour corriger les aberrations.

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9
Q

Que décrit la fonction de transfert de contraste (CTF) ?

A

La CTF modélise mathématiquement comment les aberrations du microscope affectent l’image de l’échantillon en microscopie électronique à transmission.

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9
Q

Pourquoi mesure-t-on la CTF à partir de la FFT d’une image ME ?

A

La Fast Fourier Transform (FFT) d’une image permet de déterminer la CTF et ainsi de corriger les distorsions introduites lors de l’imagerie.

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10
Q

Comment la fréquence spatiale influence-t-elle le contraste en ME ?

A

Le contraste diminue avec l’augmentation de la fréquence. Donc, à haute résolution (fréquences élevées), il y a peu de contraste.

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10
Q

Quel est l’effet du défocus sur la qualité de l’image en ME ?

A

Un plus grand défocus augmente le contraste à basse résolution, mais le contraste se désintègre plus vite à haute résolution. Typiquement, on choisit un défocus entre -1µm et -3µm.

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10
Q

Pourquoi le défocus est-il un compromis en ME ?

A

Car il y a un équilibre entre la résolution et le contraste : un petit défocus donne une meilleure résolution, mais moins de contraste, et inversement.

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11
Q

Que faut-il pour obtenir une image en microscopie électronique ?

A

Il faut détecter les électrons diffusés par le spécimen, ce qui nécessite des détecteurs spécialisés.

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12
Q

Quels sont les types de détecteurs utilisés en microscopie électronique ?

A
  1. Film : bonne qualité mais difficile à utiliser.
  2. Caméras CCD : rapides mais moins précises.
  3. Détecteurs directs d’électrons : très précis et rapides, idéaux pour l’analyse structurale moderne.
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13
Q

Qu’est-ce qu’une grille en microscopie électronique ?

A

C’est un support métallique de 2 mm de diamètre, souvent en cuivre, sur lequel on dépose les échantillons avant insertion dans le microscope.

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14
Q

Pourquoi la grille de ME doit-elle être fixée à un porteur ?

A

Pour pouvoir être insérée mécaniquement dans le microscope, la grille doit être montée sur un porteur adapté.

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15
Q

Quel est le rôle du porteur à entrée de côté en microscopie électronique ?

A

Le porteur à entrée latérale permet d’insérer la grille dans le microscope tout en protégeant l’échantillon, facilitant l’alignement et la manipulation dans le vide.

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16
Q

Comment les images sont-elles formées en microscopie électronique ?

A

Les images sont formées par la diffusion des électrons par le spécimen, ce qui génère des motifs interprétables par les détecteurs.

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17
Q

Quelle est la cause du contraste dans les images de microscopie électronique ?

A

Le contraste est causé par l’interférence entre les rayons d’électrons incidents et les électrons diffusés par l’échantillon.

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18
Q

Pourquoi utilise-t-on le défocus en microscopie électronique ?

A

Le défocus est utilisé pour amplifier le contraste, bien que cela se fasse au détriment de la résolution maximale.

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19
Q

Quel est l’avantage des détecteurs d’électrons directs (DED) ?

A

Les DED permettent de maximiser la détection des électrons grâce à leur haute fréquence d’images par seconde (IPS) et leur grande précision.

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19
Sur quoi sont généralement montés les échantillons pour la microscopie électronique ?
Les échantillons typiques sont montés sur une grille de microscopie électronique (ME), souvent en cuivre.
20
Quels sont les trois types principaux de techniques en microscopie électronique ?
1. Analyse de particules uniques (APU) 2. Tomographie 3. Cristallographie à électron.
21
Quelles méthodes sont utilisées en analyse de particules uniques (APU) ?
Les méthodes incluent : coloration négative et Cryo-EM (microscopie électronique cryogénique).
22
Quelle technique permet le fraisage de l’échantillon pour la tomographie ?
Le fraisage par rayon concentré d’ions (FIB-milling) est utilisé pour préparer les échantillons en tomographie.
23
Quelles sont les deux méthodes de cristallographie à électron ?
Les deux approches sont : cristallographie 2D et diffraction à électrons de microcristaux (MicroED).
24
Que se passe-t-il lorsqu’une macromolécule est déposée sur une grille en APU ?
Les macromolécules adoptent diverses orientations sur la grille, ce qui permet de collecter différentes projections 2D.
25
Comment obtient-on une image 3D à partir de l’APU ?
Le microscope génère des projections 2D de différentes orientations, qui sont ensuite utilisées pour reconstruire un volume 3D de la molécule.
26
Quelles sont les étapes expérimentales d’une analyse par APU ?
1. Préparer la macromolécule 2. Congélation ou coloration 3. Collecte de données 4. Sélection des particules 5. Alignement et classification 6. Reconstruction 3D 7. Modélisation.
27
L’analyse de particules uniques est-elle spécifique à certaines molécules ?
Non, elle est applicable à toute molécule purifiée et permet de gérer l’hétérogénéité structurale.
28
Quels types de molécules génèrent le plus de contraste en APU ?
Les molécules de grande taille génèrent davantage de contraste et sont donc idéales pour l’analyse.
29
Combien d’images sont nécessaires pour une expérience typique d’APU ?
Une expérience d’APU implique la collecte de milliers d’images, souvent des milliers de particules.
30
Quelle résolution peut-on atteindre avec l’APU ?
L’APU permet d’atteindre des résolutions inférieures à 4 Å, ce qui est compatible avec la modélisation atomique.
31
Quelle est la limite de taille pour analyser des protéines par APU ?
L’APU est limité aux protéines de plus de 50 kDa, ou plus de 30 kDa dans le cas de protéines membranaires.
32
Qu’est-ce que la coloration négative en microscopie électronique ?
C’est une méthode où un colorant entoure la molécule, marquant les régions sans protéine pour augmenter le contraste.
33
Quel est l’avantage de la coloration négative concernant le nombre d’images nécessaires ?
Grâce au contraste élevé, on peut analyser un échantillon avec seulement ~100 images.
33
Quelle est la limite de la coloration négative en termes de résolution ?
La résolution maximale est limitée (~15 Å), car l’image provient du colorant plutôt que de la molécule elle-même.
34
Quelle est une caractéristique des particules en cryo-ME ?
En cryo-microscopie électronique (cryo-ME), les particules sont immobilisées dans la glace vitrifiée, mais les images sont très bruyantes.
35
Combien d’images faut-il collecter en cryo-ME pour une bonne reconstruction ?
En cryo-EM, il faut collecter entre 1 000 et 10 000 images pour avoir suffisamment de données pour une reconstruction 3D fiable.
36
Qu’est-ce qui limite la résolution en cryo-ME ?
La résolution en cryo-EM est limitée uniquement par les aberrations du microscope et la longueur d’onde des électrons, car on mesure directement les particules.
36
Comment prépare-t-on un échantillon pour l’APU ?
En APU, quelques microlitres d’une solution de macromolécules biologiques sont déposés sur une grille de microscopie électronique.
37
Quelle est la différence de support entre la coloration négative et la cryo-ME ?
Les grilles de coloration négative utilisent un carbone continu, tandis que la cryo-ME utilise du carbone perforé pour ne visualiser que la glace vitrifiée.
38
Quel type de grille est typiquement utilisé en APU ?
La microscopie par APU utilise généralement une grille de ME en carbone perforé.
38
Comment se déroule la coloration en microscopie électronique négative ?
Après l’application de l’échantillon sur la grille, un colorant est ajouté pour augmenter le contraste, marquant les zones sans protéines.
39
Sur quels types de biomolécules la coloration négative fonctionne-t-elle mieux ?
La coloration négative fonctionne bien avec les protéines, mais est moins efficace avec les acides nucléiques, et est souvent utilisée pour le criblage initial.
40
Quels colorants sont utilisés pour la coloration négative ?
Les colorants communs sont : acétate d’uranium, formate d’uranium, tungstates et molybdates.
41
Pourquoi la glace doit-elle être vitrifiée en cryo-ME ?
En cryo-ME, la glace cristalline est opaque aux électrons, alors que seule la glace vitrifiée est transparente, permettant l’imagerie.
42
Qui a découvert la vitrification pour la cryo-ME et avec quoi ?
Dubochet et Lepault ont découvert qu’on peut vitrifier la glace en utilisant des cryogènes à haut taux de refroidissement comme l’éthane liquide.
43
Quelle propriété des molécules en solution est utilisée en APU ?
L’APU utilise le fait que les molécules en solution adoptent des orientations aléatoires, ce qui permet la reconstruction 3D.
44
Quelle est l’utilité de la coloration négative en microscopie électronique ?
Elle permet de visualiser les protéines avec un contraste élevé, mais avec une résolution maximale limitée, et est souvent utilisée pour le criblage initial.
45
Pourquoi utilise-t-on la cryo-ME au lieu de la coloration négative ?
La cryo-ME permet d’obtenir des structures haute résolution, mais nécessite beaucoup plus de données que la coloration négative.
46
Quelle condition est essentielle pour la glace utilisée en cryo-ME ?
La glace doit être vitrifiée, c’est-à-dire congelée très rapidement, en utilisant de l’éthane ou un mélange éthane-propane.
47
Pourquoi faut-il ajuster la dose d’électrons en cryo-ME ?
Parce que les électrons causent des dommages aux molécules, il faut ajuster la dose pour minimiser les dégâts tout en maintenant un bon contraste.
48
Qu’est-ce que le mouvement induit par les électrons en cryo-ME ?
C’est un effet secondaire où l’impact des électrons dévie légèrement la trajectoire du faisceau, causant un flou dans l’image.
49
Quel avantage a offert la technologie des détecteurs directs d’électrons (DED) ?
Grâce à leur haute fréquence d’images par seconde (IPS), les DED permettent de filmer une série d’images (10+ images) pour une seule acquisition.
50
Pourquoi prend-on plusieurs images successives (films) en cryo-ME ?
Cela permet de corriger le flou causé par le mouvement et d’améliorer la résolution finale en combinant les informations des différentes images.
51
Comment corrige-t-on les images dégradées en cryo-ME ?
Les images sont dégradées par la fonction de transfert de contraste (CTF). On peut l’estimer via la transformée de Fourier (FFT) pour corriger l’image.
51
Pourquoi la qualité de l’image est-elle cruciale pour la CTF ?
Plus l’image est de haute qualité, plus l’estimation de la fonction de transfert de contraste (CTF) sera précise, ce qui améliore la correction de l’image.
51
Quelle est la première étape après la correction d’image en cryo-ME ?
Après correction, on procède à la sélection des particules, c’est-à-dire identifier dans l’image les emplacements de notre molécule d’intérêt.
52
Qu’est-ce que la sélection de particules en cryo-ME ?
Il s’agit de trouver les régions de contraste dans les images qui correspondent aux particules biologiques recherchées.
53
Quelles méthodes sont utilisées pour sélectionner les particules ?
On peut utiliser la recherche de blobs, de motifs spécifiques, ou des méthodes d’apprentissage par intelligence artificielle (IA).
54
Quel est le rôle de la classification 2D en cryo-ME ?
Elle permet d’aligner et classifier les différentes particules en 2D pour révéler les diverses orientations de la molécule.
55
Pourquoi la classification 2D est-elle essentielle ?
Elle est une étape clé pour la sélection des bonnes particules, en éliminant les artefacts et les mauvaises alignements.
55
Comment peut-on reconstruire un volume 3D à partir d’images 2D ?
En utilisant les projections 2D alignées (issues de la classification 2D), on peut reconstruire un volume 3D de la particule.
55
Pourquoi la reconstruction 3D à partir de projections 2D est-elle difficile ?
Il est difficile de déterminer l’orientation relative des images 2D. Cela se fait souvent dans l’espace de Fourier pour simplifier le processus.
56
Quelle est la méthode standard pour reconstruire un volume 3D ?
La reconstruction Ab initio est la méthode standard actuelle. Elle part d’un volume gaussien initial avec des orientations aléatoires.
57
Quelle hypothèse de départ utilise la reconstruction Ab initio ?
Elle utilise un volume gaussien (blob) comme point de départ et affine progressivement les orientations des images.
58
Pourquoi filtrer les hautes fréquences lors de la reconstruction 3D ?
Pour éviter l’overfitting, c’est-à-dire l’amplification du bruit, il est essentiel de filtrer les hautes fréquences dans les données.
59
Quels sont les avantages et inconvénients de la reconstruction Ab initio ?
La méthode est simple mais computationnellement intensive, car elle implique le raffinement de nombreuses images.
60
Quelle précaution prend-on lors de la reconstruction 3D pour éviter le bruit ?
On filtre les hautes fréquences pour éviter d’amplifier le bruit et de fausser le modèle reconstruit (overfitting).
61
Pourquoi la reconstruction 3D est-elle computationnellement intensive ?
Parce qu’elle nécessite de raffiner chaque image de particule, typiquement plus de 100 000 images, ce qui demande beaucoup de puissance de calcul.
62
Quel est le principe de la reconstruction 3D à partir d’un volume initial ?
On compare les projections 2D expérimentales avec celles calculées à partir d’un volume initial (souvent un blob) pour l’affiner progressivement.
63
Comment mesure-t-on la résolution d’une reconstruction cryo-ME ?
On utilise la corrélation de sphère de Fourier (FSC), qui compare la cohérence entre deux reconstructions indépendantes.
63
Que mesure exactement la FSC ?
Elle mesure la corrélation des mêmes sphères dans l’espace de Fourier entre deux reconstructions indépendantes.
64
Comment obtient-on les données pour calculer la FSC ?
On divise le jeu de données en deux parties distinctes et génère deux reconstructions 3D pour en comparer la cohérence.
65
Quel critère définit la résolution selon la FSC ?
La résolution est atteinte lorsque la corrélation descend sous un seuil (0.5 ou 0.143) dans la courbe FSC, indiquant la limite d'information fiable.
66
Quelle est la relation entre la résolution cryo-ME et la modélisation ?
À 4 Å de résolution, il est souvent possible de tracer la chaîne peptidique. Une reconstruction cryo-ME à une résolution α offre une densité équivalente à une résolution α - 1 Å en cristallographie (calcul parfait des phases).
67
Pourquoi l’hétérogénéité des complexes est-elle un défi en cryo-ME ?
Les échantillons purifiés pour la cryo-ME sont rarement 100 % homogènes, ce qui complique l’analyse. Il peut y avoir plusieurs composants comme une protéine cible et un contaminant.
67
Comment une approche in silico aide-t-elle en cryo-ME ?
Une approche in silico permet de distinguer différentes composantes d’un échantillon hétérogène, facilitant ainsi l’obtention rapide d’une structure haute résolution.
68
Quelle est l’utilité de la classification 3D en cryo-ME ?
La classification 3D permet d’analyser l’hétérogénéité d’un échantillon et de classer ses différentes composantes à l’aide d’approches statistiques.
69
Quelles sont les étapes clés pour obtenir une structure haute résolution en APU ?
1. Ajuster la dose d’électrons 2. Corriger le mouvement 3. Estimer et corriger la CTF 4. Sélectionner et classifier les particules 5. Reconstruire un modèle 3D 6. Gérer l’hétérogénéité avec la classification 3D.
69
À quelle technique la tomographie électronique est-elle similaire ?
Elle est similaire à la tomodensitométrie, utilisant plusieurs images sous différents angles pour reconstruire une image 3D d’un objet.
70
Comment fonctionne la tomographie électronique ?
Elle consiste à combiner plusieurs images du même objet prises à différents angles pour obtenir une reconstruction 3D.
71
Pourquoi utilise-t-on un haut voltage en tomographie électronique ?
Parce que les échantillons sont plus épais, ce qui nécessite un voltage plus élevé pour obtenir des images de qualité suffisante.
72
Quelle est la principale limitation de la tomographie électronique ?
Elle est limitée par le cône manquant, une zone de données absentes due à l’impossibilité de tourner l’échantillon à tous les angles, ce qui affecte la résolution.
73
Qu’est-ce que le FIB-milling en tomographie électronique ?
Le fraisage par faisceau d’ions concentré (FIB) est utilisé pour créer des échantillons minces adaptés à la tomographie électronique.
73
Quelle est la différence entre cryo-tomographie et APU en cryo-ME ?
Cryo-tomographie est utilisée pour les cellules, organelles, virus, tandis que l’analyse de particules uniques (APU) est utilisée pour les molécules purifiées.
74
Quelle technique de biologie structurale nécessite le plus de matériel ?
La cristallographie à rayons X demande le plus de matériel (≈10 mg), suivie de la RMN (1-10 mg), puis de la cryo-ME (0.1-1 mg).
74
Quelles sont les concentrations typiques pour les échantillons en biologie structurale ?
Pour la cristallographie et la RMN, la concentration idéale est >5 mg/mL. Pour la cryo-ME, elle est de 0.1-5 mg/mL.
75
Quel est l’état de l’échantillon dans chaque technique de biologie structurale ?
En cristallographie à rayons X : échantillon sous forme de cristal, tandis qu’en RMN et en cryo-ME, l’échantillon est en solution.
76
Quelles sont les tailles typiques des échantillons selon la technique ?
En cristallographie : souvent <100 kDa (ce qui cristallise), en cryo-ME : >30 kDa, et en RMN : <30 kDa.
77
Quelle est la durée typique d'une expérience pour chaque méthode ?
RMN prend plusieurs semaines, la cryo-ME entre 24 et 72 h, et la cristallographie seulement quelques heures.
78
Quelles sont les résolutions limites des principales techniques ?
RMN : ~2.0-2.5 Å, cryo-ME : 1.22 Å, cristallographie : 0.5 Å.
79
Quels sont les critères de validation des structures selon la méthode ?
Cristallographie : Ramachandran, Facteur R, CC1/2 ; RMN : RMSD, Ramachandran ; Cryo-ME : Ramachandran, FSC.
79
Pourquoi la cryo-ME est-elle considérée polyvalente ?
Car elle permet de visualiser à la fois des molécules purifiées, des cristaux et des échantillons cellulaires ou viraux.
80
Comment la cryo-ME complète-t-elle les autres techniques de biologie structurale ?
Elle permet de visualiser de grands complexes macromoléculaires en solution avec relativement peu de matériel.
81
Pourquoi la cryo-ME est-elle devenue une technique phare ?
Grâce aux progrès des détecteurs et du traitement d’image, la cryo-ME est maintenant la technique phare de la biologie structurale.

BCM 2501 (13 decks)

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