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Génétique (GNT305) > Cours 9 > Flashcards

Cours 9 Flashcards

1
Q

Comment se protège l’organisme des m.o?

A

minimisant les concentrations de fer libre dans l’organisme

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Q

Exemple de stratégies développées par les m.o afin de subtiliser le fer?

A

Induction de l’expression du gène codant pour des récepteurs ou transporteurs spécifiques pour
- sidérophores
- protéines associées à l’hème, hémoglobine, etc
- Protéine associées au Fe inorganique

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Q

Siderocalin

A

se lie à des sidérophores bactérien et les séquestrent empêchant le retour dans bactérie

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4
Q

haptoglobin

A

se lie à hémoglobine libre

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Q

Hemopexin

A

se lie à hème libre

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6
Q

transferrin et lactoferrin

A

se lie aux ions de Fe

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7
Q

Levure (S.pombe)

A
  • eucaryote unicellulaire
  • plusieurs caractéristiques des cellules animales (division cell)
  • 1er génome séquencé
  • 2 états dans cycle sexuel (haploide et diploide)
  • Chromosomes et compartiements
  • protéines présentes chez levures filamenteuses et pathogènes
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8
Q

Mécanismes employés par S.pombe pour obtenir Fe des sources externes

A

expression gènes codant pour divers transporteurs:
1- fe élémentaire: transporté par la machinerie incluant protéines ferriréductase
2- Hème: capté par glycoprotéine de surface Shu et transporteur Str3
3- Sidérophore

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9
Q

Candidat logique pour tester approche génétique

A

SPBC4F6.09 ou str1+

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10
Q

Pourquoi choisir str1 ou SPBC4F6.09?

A
  • expression induite en carence de Fe
  • gène régulé par le facteur de transcription Fe-dépendant (Fep1)
  • gène code pour une protéine prédite comme “transporteur”
  • protéine possédant plusieurs domaines transmembranaires
  • protéine similaire à d’autres protéines fongiques candidates pour transporter sidérophores
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11
Q

Remplacement du gène str1+

A
  • par gène de résistance G418
  • étalement sur milieu avec G418
  • résulte en une souche ne produisant aucun transcrit str1+ (ARNm str1+)
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12
Q

Que permet la présence des séquences loxP?

A
  • recycler la cassette de résistance KanMX afin de pouvoir refaire un nouveau “knock out” d’un second gène
  • utilise la recombinase CRE
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13
Q

Expulsion du plasmide ura4+ codant pour la CRE

A
  • étale cellules sur milieu contenant du 5-FOA
  • converti en un produit toxique qui est produit par la décarboxylase (du gène ura4+)
  • cells expulsent plasmide pour survivre
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14
Q

Méthode pour valider absence de str1+ sur transcrit

A

RT-PCR standard ou en temps réel

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15
Q

Activité polymérase

A
  • 5’->3’ polymérisation
  • 3’->5’ exonucléolytique (correction)
  • 5’ -> 3’ exonucléolytique (déplacement de brin, dégrade brin en avant pour permettre la synthèse d’un nouveau brin en arrière)
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16
Q

Fonctionnement RT-PCR pour les souches

A
  • isolement arn de la souche de type sauvage (contrôle +) et souche str1Δ (souche à tester)
  • ajout mixte de rct (RT, DNA polymérase thermostable, amorce sens, amorce anti-sens, taqman)
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17
Q

but du pcr

A
  • comparer souche sauvage (str1+) à celle qui a subit la délétion du gène str1
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18
Q

Validation de la souche str1Δ nulle ne produisant plus de transcrits str1+ par la méthode RNase protection

A
  • ARN antisens marqué
  • total ARNm isolés de la source str1Δ ou sauvage
  • hybridation
  • digestion à la RNase T1
  • détection spécifique des transcrits appariés
  • analyse sur gel
19
Q

Résultats validation

A
  • souche sauvage (str1+): transcrits détectés
  • souche str1Δ nulle: aucun
20
Q

Du point de vue génétique, y a-t-il un phénotype qui est associé à l’inactivation du gène str1+ ?

A
  • hypothèse: identification du transporteur responsable de l’entrée du sidérophore
  • question: est ce que la souche str1Δ nulle peut acquérir le ferrichrome
21
Q

résultat génétique souche str1Δ nulle essai acquisition ferrichrome

A
  • perte de fonction
  • incapacité à transformer le FC
  • rien sur gel
22
Q

Objectifs réintégration de l’allèle str1+-GFP dans souche str1Δ nulle

A
  • restaurer le phénotype ou la perte de fct causée par le KO ou l’inactivation de l’allèle sur str1Δ
  • déterminer rapidement la localisation cellulaire de la protéine
23
Q

Prototrophe

A

organisme qui possède la capacité de biosynthétiser une composante essentielle à sa survie cellulaire

24
Q

auxotrophe

A

organisme incapable de biosynthétiser une composante essentielle à sa survie cellulaire. Composante doit être fournie de façon exogène à l’organisme dans son milieu ou son alimentation

25
Q

Plasmide YIp

A

allèles sauvages str1+-GFP et leu1+

26
Q

À quoi sert l’étalement sur le milieu sans leucine?

A

permettra à souche de croître sur un milieu sans leucine et d’exprimer le gène str1+-GFP

27
Q

À quoi sert l’intégration de l’allèle str1+-GFP

A

rétablie perte de fct causée par la délétion de l’allèle str1Δ

28
Q

allèle str1+-GFP

A
  • code pour protéine fonctionnelle
  • la protéine de fusion Str1-GFP peut être étudiée avec confiance
29
Q

L’intégration de l’allèle str1+-GFP produit un transcrit, qui lui, est traduit en une protéine, qui elle

A

se localise à la surface cellulaire

30
Q

à quels niveaux des programmes cellulaires peut être analysée l’expression d’une protéine chez la levure?

A

1) cycle végétatif (mitose)
2) sporulation (méiose)
3) germination (sortie de dormance)

31
Q

quand est localisée la protéine str1-GFP

A

processus de germination des spores afin d’identifier si elle pouvait avoir un rôle important dans ce programme de développement

32
Q

Ou apparait Str1-GFP

A

au niveau de la cellule fille qui émerge de la spore qui a germé

33
Q

qu’est ce qui entraîne arrêt de la germination au stade de croissance isotropique?

A

knock out str1Δ du gène str1+

34
Q

2e organisme modèle (Souris Mus musculus)

A
  • cycle biologique lent
  • conditions expérimentales moins facile à contrôler
  • gestation 20 jours
  • développement embryonnaire bien connu
  • syst permettant production de souris transgénqiue
  • invalidation (KO) par recombinaison homologue est possible
  • synténie est bonne entre humain et souris
35
Q

Embryogénèse souris transgénique

A
  • techniques micromanipulation pour introduire adn recombinants par injection
  • adn injecté dans le pronucléus d’un œuf
  • adn s’intègre à position aléatoire dans génome
36
Q

Morula

A
  • stade au niveau duquel la première diversification visible de l’embryon apparaît
  • cellules périphériques formeront le placenta
37
Q

masse cellulaire interne (ICM) ou embryoblaste

A
  • forme tissu futur fœtus
  • cellules souches embryonnaires
  • différencier dans n’importe lequel type de cellules à conditions qu’elles soient en présence des bons facteurs de croissance
38
Q

Si matériel génétique correctement intégré au génome au cours de l’embryogénèse, que se passe t’il?

A

Phénotype conférant un gain de fct à l’animal pourra être observé

39
Q

Hoxb2

A

séquence régulatrice qui lorsque fusionnée à un gène rapporteur permet la détection du produit polypeptidique au niveau de la région protocervicale

40
Q

Désavantages souris transgénique

A
  • pas de souris modifiées si injection fonctionne pas
  • expression du transgène ne doit pas interférer avec le développement embryonnaire
  • pas tous descendants avec transgène
  • transgène peut s’intégrer à plus d’un endroit dans le génome
  • transgène peut ne pas s’exprimer si s’intègre dans hétérochromatine
  • insertion du transgène peut produire un dommage irréversible en mutant
41
Q

ganciclovir

A
  • analogue nucléosidique qui bloque réplication de l’ADN
42
Q

Désavantages souris knock out

A
  • inactivation de certains gènes peut être fatal
  • sans souris, rien étudier
  • gène peut avoir différents rôles à différents stades
  • inactivation = pas de phénotype apparent
  • cellules souches peuvent variées d’un type de souris à l’autre
43
Q

Souris transgénique vs knock out

A
  • trans: souris qui exprime une ou plusieurs copies d’un gène qui a été intégré à l’intérieur de son génome de façon aléatoire
  • KO: 2 allèles du gène ont été délétés de façon précise par recombinaison homologue
44
Q

Intégration par recombinaison homologue (avec plasmide Yip)

A
  • absence de séquences permettant réplication autonome
  • extrémités libres d’un fragment représentent points chauds de recombinaisons
  • au niveau de séquences chromosomiques à extrémités libres

Génétique (GNT305) (11 decks)

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