Cours 9

Question 1

Comment se protège l’organisme des m.o?

Answer 1

minimisant les concentrations de fer libre dans l’organisme

Question 2

Exemple de stratégies développées par les m.o afin de subtiliser le fer?

Answer 2

Induction de l’expression du gène codant pour des récepteurs ou transporteurs spécifiques pour
- sidérophores
- protéines associées à l’hème, hémoglobine, etc
- Protéine associées au Fe inorganique

Question 3

Siderocalin

Answer 3

se lie à des sidérophores bactérien et les séquestrent empêchant le retour dans bactérie

Question 4

haptoglobin

Answer 4

se lie à hémoglobine libre

Question 5

Hemopexin

Answer 5

se lie à hème libre

Question 6

transferrin et lactoferrin

Answer 6

se lie aux ions de Fe

Question 7

Levure (S.pombe)

Answer 7

• eucaryote unicellulaire
• plusieurs caractéristiques des cellules animales (division cell)
• 1er génome séquencé
• 2 états dans cycle sexuel (haploide et diploide)
• Chromosomes et compartiements
• protéines présentes chez levures filamenteuses et pathogènes

Question 8

Mécanismes employés par S.pombe pour obtenir Fe des sources externes

Answer 8

expression gènes codant pour divers transporteurs:
1- fe élémentaire: transporté par la machinerie incluant protéines ferriréductase
2- Hème: capté par glycoprotéine de surface Shu et transporteur Str3
3- Sidérophore

Question 9

Candidat logique pour tester approche génétique

Answer 9

SPBC4F6.09 ou str1+

Question 10

Pourquoi choisir str1 ou SPBC4F6.09?

Answer 10

• expression induite en carence de Fe
• gène régulé par le facteur de transcription Fe-dépendant (Fep1)
• gène code pour une protéine prédite comme “transporteur”
• protéine possédant plusieurs domaines transmembranaires
• protéine similaire à d’autres protéines fongiques candidates pour transporter sidérophores

Question 11

Remplacement du gène str1+

Answer 11

• par gène de résistance G418
• étalement sur milieu avec G418
• résulte en une souche ne produisant aucun transcrit str1+ (ARNm str1+)

Question 12

Que permet la présence des séquences loxP?

Answer 12

• recycler la cassette de résistance KanMX afin de pouvoir refaire un nouveau “knock out” d’un second gène
• utilise la recombinase CRE

Question 13

Expulsion du plasmide ura4+ codant pour la CRE

Answer 13

• étale cellules sur milieu contenant du 5-FOA
• converti en un produit toxique qui est produit par la décarboxylase (du gène ura4+)
• cells expulsent plasmide pour survivre

Question 14

Méthode pour valider absence de str1+ sur transcrit

Answer 14

RT-PCR standard ou en temps réel

Question 15

Activité polymérase

Answer 15

• 5’->3’ polymérisation
• 3’->5’ exonucléolytique (correction)
• 5’ -> 3’ exonucléolytique (déplacement de brin, dégrade brin en avant pour permettre la synthèse d’un nouveau brin en arrière)

Question 16

Fonctionnement RT-PCR pour les souches

Answer 16

• isolement arn de la souche de type sauvage (contrôle +) et souche str1Δ (souche à tester)
• ajout mixte de rct (RT, DNA polymérase thermostable, amorce sens, amorce anti-sens, taqman)

Question 17

but du pcr

Answer 17

• comparer souche sauvage (str1+) à celle qui a subit la délétion du gène str1

Question 18

Validation de la souche str1Δ nulle ne produisant plus de transcrits str1+ par la méthode RNase protection

Answer 18

• ARN antisens marqué
• total ARNm isolés de la source str1Δ ou sauvage
• hybridation
• digestion à la RNase T1
• détection spécifique des transcrits appariés
• analyse sur gel

Question 19

Résultats validation

Answer 19

• souche sauvage (str1+): transcrits détectés
• souche str1Δ nulle: aucun

Question 20

Du point de vue génétique, y a-t-il un phénotype qui est associé à l’inactivation du gène str1+ ?

Answer 20

• hypothèse: identification du transporteur responsable de l’entrée du sidérophore
• question: est ce que la souche str1Δ nulle peut acquérir le ferrichrome

Question 21

résultat génétique souche str1Δ nulle essai acquisition ferrichrome

Answer 21

• perte de fonction
• incapacité à transformer le FC
• rien sur gel

Question 22

Objectifs réintégration de l’allèle str1+-GFP dans souche str1Δ nulle

Answer 22

• restaurer le phénotype ou la perte de fct causée par le KO ou l’inactivation de l’allèle sur str1Δ
• déterminer rapidement la localisation cellulaire de la protéine

Question 23

Prototrophe

Answer 23

organisme qui possède la capacité de biosynthétiser une composante essentielle à sa survie cellulaire

Question 24

auxotrophe

Answer 24

organisme incapable de biosynthétiser une composante essentielle à sa survie cellulaire. Composante doit être fournie de façon exogène à l’organisme dans son milieu ou son alimentation

Question 25

Plasmide YIp

Answer 25

allèles sauvages str1+-GFP et leu1+

Question 26

À quoi sert l'étalement sur le milieu sans leucine?

Answer 26

permettra à souche de croître sur un milieu sans leucine et d'exprimer le gène str1+-GFP

Question 27

À quoi sert l'intégration de l'allèle str1+-GFP

Answer 27

rétablie perte de fct causée par la délétion de l'allèle str1Δ

Question 28

allèle str1+-GFP

Answer 28

- code pour protéine fonctionnelle - la protéine de fusion Str1-GFP peut être étudiée avec confiance

Question 29

L’intégration de l’allèle str1+-GFP produit un transcrit, qui lui, est traduit en une protéine, qui elle

Answer 29

se localise à la surface cellulaire

Question 30

à quels niveaux des programmes cellulaires peut être analysée l'expression d'une protéine chez la levure?

Answer 30

1) cycle végétatif (mitose) 2) sporulation (méiose) 3) germination (sortie de dormance)

Question 31

quand est localisée la protéine str1-GFP

Answer 31

processus de germination des spores afin d'identifier si elle pouvait avoir un rôle important dans ce programme de développement

Question 32

Ou apparait Str1-GFP

Answer 32

au niveau de la cellule fille qui émerge de la spore qui a germé

Question 33

qu'est ce qui entraîne arrêt de la germination au stade de croissance isotropique?

Answer 33

knock out str1Δ du gène str1+

Question 34

2e organisme modèle (Souris Mus musculus)

Answer 34

- cycle biologique lent - conditions expérimentales moins facile à contrôler - gestation 20 jours - développement embryonnaire bien connu - syst permettant production de souris transgénqiue - invalidation (KO) par recombinaison homologue est possible - synténie est bonne entre humain et souris

Question 35

Embryogénèse souris transgénique

Answer 35

- techniques micromanipulation pour introduire adn recombinants par injection - adn injecté dans le pronucléus d'un œuf - adn s'intègre à position aléatoire dans génome

Question 36

Morula

Answer 36

- stade au niveau duquel la première diversification visible de l'embryon apparaît - cellules périphériques formeront le placenta

Question 37

masse cellulaire interne (ICM) ou embryoblaste

Answer 37

- forme tissu futur fœtus - cellules souches embryonnaires - différencier dans n'importe lequel type de cellules à conditions qu'elles soient en présence des bons facteurs de croissance

Question 38

Si matériel génétique correctement intégré au génome au cours de l'embryogénèse, que se passe t'il?

Answer 38

Phénotype conférant un gain de fct à l'animal pourra être observé

Question 39

Hoxb2

Answer 39

séquence régulatrice qui lorsque fusionnée à un gène rapporteur permet la détection du produit polypeptidique au niveau de la région protocervicale

Question 40

Désavantages souris transgénique

Answer 40

- pas de souris modifiées si injection fonctionne pas - expression du transgène ne doit pas interférer avec le développement embryonnaire - pas tous descendants avec transgène - transgène peut s'intégrer à plus d'un endroit dans le génome - transgène peut ne pas s'exprimer si s'intègre dans hétérochromatine - insertion du transgène peut produire un dommage irréversible en mutant

Question 41

ganciclovir

Answer 41

- analogue nucléosidique qui bloque réplication de l'ADN

Question 42

Désavantages souris knock out

Answer 42

- inactivation de certains gènes peut être fatal - sans souris, rien étudier - gène peut avoir différents rôles à différents stades - inactivation = pas de phénotype apparent - cellules souches peuvent variées d'un type de souris à l'autre

Question 43

Souris transgénique vs knock out

Answer 43

- trans: souris qui exprime une ou plusieurs copies d'un gène qui a été intégré à l'intérieur de son génome de façon aléatoire - KO: 2 allèles du gène ont été délétés de façon précise par recombinaison homologue

Question 44

Intégration par recombinaison homologue (avec plasmide Yip)

Answer 44

- absence de séquences permettant réplication autonome - extrémités libres d'un fragment représentent points chauds de recombinaisons - au niveau de séquences chromosomiques à extrémités libres