Cours 6 Flashcards
Avant l’identification du RCT et de la détermination qu’un fragment peptidique de l’antigène associé au CMH etait reconnu par le RCT, il y avait deux modèles de la reconnaissance antigénique par les cellules T.
Expérience
DEUX RÉCEPTEURS SÉPARÉS, l’un reconnaissant
le CMH et l’autre reconnaissant l’antigène (« double
récepteur »)
UN SEUL RÉCEPTEUR, capable de reconnaître
l’antigène complexé avec une molécule du CMH du Soi (« Soi modifié »)
Dans cette expérience, Kappler et Marrack ont fusionné deux clones de cellules T de spécificité antigénique différentes et de restriction au CMH différents. Un clone est spécifique pour l’antigène OVA et la molécule de classe II I-Ak et l’autre clone est spécifique pour l’antigène KLH et la molécule de classe II I-Af.
Si le modèle du double récepteur (un récepteur reconnaît l’antigène et l’autre le CMH) est vrai, la cellule fusionnée devrait reconnaître l’antigène OVA aussi bien sur des cellules présentatrices d’Ag de CMH IAk ou IAf ainsi que reconnaître KLH sur des cellules présentatrices d’Ag de CMH IAk et Iaf
Si le modèle du soi-modifié (un seul récepteur reconnaît l’antigène et le CMH) est vrai, la cellule fusionnée ne pourra que reconnaître l’Ag OVA sur une cellule présentatrice d’Ag portant le CMH IAk et l’Ag KLH sur une cellule présentatrice d’Ag exprimant le CMH IAf
Les résultats expérimentaux démontrent que le modèle du soi-modifé (ou un récepteur reconnaît l’Ag et le CMH) est vrai.
Identification tardive du RcT p/r aux Ac
Difficultés rencontrées
-Les cellules T devaient posséder un récepteur antigène spécifique et clonotypique
-Récepteur membranaire (pas de forme soluble)
-Interaction plus faible avec l’antigène que les anticorps
-Spécifique pour l’antigène et le CMH = double
EXPÉRIENCE QUI A PERMIS D’ISOLER LE RCT
- Production d’un hybridome T spécifique pour l’Ag ovalbumine (OVA): Immunisation de souris avec l’Ag OVA, attend quelques jours, prélève les ganglions lymphatiques (site de la réponse T), cultive les cellules avec l’Ag OVA afin d’enrichir en cellules T spécifiques pour OVA (seules les cellules spécifiques pour OVA vont proliférer dans ces conditions)
- Fusion avec une lignée de cellules T immortalisées: production hybridomes T
- Clonage par dilution limite afin d’obtenir des hybridomes T dérivant d’une seule cellule T fusionnée. Ceci afin d’avoir des cellules T qui expriment toutes le même RCT)
- Utilise cet hybridome T comme source d’Ag pour tenter d’obtenir des Ac monoclonaux dirigés contre le RCT
- Quelques jours après immunisation, prélève la rate, fusionne avec lignée de cellules B immortalisées, clonage par dilution limite afin d’obtenir des Ac monoclonaux qui reconnaissent l’hybridome T utilisé lors de l’immunisation
6.Sélection et amplification des clones qui sécrètent des Ac qui se fixent aux hybridomes T
- Identification d’un Ac qui lie le RCT en déterminant si l’ajout de l’Ac inhibe la reconnaissance antigénique et donc l’activation de l’hybridome T. La stimulation des hybridomes T se fait en les incubant avec des cellules présentatrices d’antigène chargées avec l’antigène et possédant le bon CMH (cellules jaunes dans le schéma)
- Utilisation de l’Ac monoclonal pour immunoprécipiter le RCT et démontrer qu’il est composé de deux chaines d’environ 45 kDa
structure TCR
Membre de la superfamille des Ig
2 chaine (alpha et beta) possède 2 domaines (variable et ct) contenant chacun un pont di-s intrachaine
Nter variation marquée de la séquence d’un RCT à l’autre: 2domaine variable avec ses 3 régions hypervariables
Proximal à la membrane=2 domaine constant ou C
Région transmembranaire de 21-22 aa, contiennent des résidus chargés positivement, inhabituel pour un domaine membranaire
Courte queue cytoplasmique en Cter
Réarrangement du RCT (recombinaison qui augmente diversité)
Dans la réagion variable (Nter)
chaine alpha=VJ
chaine beta=VDJ
qu’Estce qui est important pour la recombinaison du TCR
seq RSS (même principe que pour Ac)
Afin de positionner les
RSS du même coté de la
double hélice d’ADN afin
de les rendre accessibles à
une même enzyme
23=2 tour
12= 1 tour
structure du RSS du chaine alpha et beta
chaine alpha= V23—12J
chaine beta= V23—12D23—12J
étape de remcombinaison pour VDJ( quel partie en premier)
- DJ en premier
- V se recombine à DJ après
rôle de Rag1/2, Tdt, Artémis et ligase
rag= reconnait RSS et coupe en 2: joint codant et siganl
tdt= ajout n nuclotide
artémis= endonucléase coupe hairpin
ligase= liagation de ADN apres tdt
Seules Rag1, Rag2 et TdT sont spécifiques des lymphocytes. Les autres protéines sont celles qui agissent dans la voie de réparation de l’ADN par jonctions d’extrémités non homologues (NHEJ) et sont donc exprimées par tous les types cellulaires.
étape recombinaison
- HMG Rag1/2 plie adn et apporte segment proche + coupe=cassure simple dans un des brins d’ADN exactement en 5’ de l’heptamère du SSR des segments de gène V et J.
- Trans-estérification. Le groupement 3’OH généré par le clivage de Rag1/2 va attaquer le groupement phosphate de l’autre brin d’ADN (trans-estérification) créant une extrémité en épingle à cheveu au niveau de l’extrémité codante (à coté du segment de gène V ou J; coding end ds le schéma) et une extrémité franche au niveau du bout signal (signal end ds le schéma).
L’extrémité franche de la jonction signal sera liguée pour former un cercle de recombinaison qui sera éventuellement perdu
Étape 3. Ouverture de la structure en épingle à cheveu par Artemis. Notez que cette ouverture peut avoir lieu à différent endroit dans l’épingle à cheveu. Selon l’endroit où l’ouverture sera faite cela créera différentes extrémités (cohésives (overhang ds le schéma) en 5’ ou 3’ ou franches).
Étape 4. Ajout des P-nucléotides. Les extrémités cohésives sont remplies par une polymérase en utilisant l’information du brin complémentaire *seq palindrome
Étape 5. à l’occasion avant que les extrémités soient remplies par la polymérase, il arrive que des exonucléases enlèvent des nucléotides.
Étape 6. Ajout de N-nucléotides ajout de nucléotides de façon aléatoire et indépendante de la matrice d’ADN par l’enzyme Tdt (terminal deoxy transferase)
Étape 7. Ligation des extrémités pour former la jonction codante. Utilises les enzymes classiques de la réparation des cassures d’ADN double brin
Génération de la diversité
Diversité génique (polymorphisme)
Diversité combinatoire (V, D, J).
P-nucléotides (Artemis).
N-nucléotides (TdT).++++++
Activité exonucléase.
Réassortiment des a et des b.
- Pas d’hypermutation somatique.
V ou F. Un LT exprime un seul type de TCR spécifique
Vrai
Exclusion allélique
le réarrangement productif (qui code pour une protéine fonctionnelle) de la chaine alpha ou beta mène à l’arrêt du réarrangement au locus respectif.
qu’est ce qu’on retrouve dans les régions variables du TCR
CDR1,2,3
alpha: 1 et 2 dans V et 3 à la jct VJ
beta: 1 et 2 dans V et 3 à la jct VD et DJ
Quelle région CDR1/2 ou CDR3 possède le plus
de diversité de séquences?Quelle région va être impliquée dans la reconnaissance du peptide antigénique?
3
interaction CDR-CMH
CDR1 et 2 interagissent principalement avec les hélices alpha du CMH
CDR3 interagit avec le peptide
Boucle cdr4 n’interagit pas avec le complexe CMH-peptide
Fct du complexe CD3
TCR=RECONNAISSANCE
CD3=
transduction signal
expression de TCR à la surface cell (stabilise la charge + intracell)
structure CD3
Cinq chaînes invariantes (g, d, e, z, h) exprimées avec le RcT à la surface cellulaire.
complexe de 6 polypeptides invariables formés de 3 dimères: ge (gamma-epsilon), de (delta-epsilon) et zz (zeta-zeta) desfois zeta-heta (10%)
Régions cytoplasmiques contiennent des motifs ITAMs qui vont servir de sites de recrutement à des protéines adaptatrices suite à leur phosphorylation induite par l’activation
2 tm avec charge -
CD3gde sont des membres de la superfamille des Ig, domaine extracelluaire est un domaine immunoglobuline; région cytoplasmique d’environ 40aa
CD3z très courte région extracellulaire (9aa); longue queue cytoplasmique de 113aa
L’affinité du RcT pour le complexe antigène-CMH est plutôt…..
Faible à cause selction neg
solution pour augmenter l’avidité du TCR pour son Ag
- ADHÉSINES
augmente l’interaction entre la cellule T et la cellule présentatrice d’antigène (CPA)
CO-RÉCEPTEURS
Intéractions spécifiques avec région conservé
CMH I (CD8)
Intéractions spécifiques avec région conservé
CMH II (CD4)
* Participent à la signalisation
structure
a)CD4
b)CD8
a) 4 domaine Ig + Tyr kinase intracell
b) dimer (alpha et beta) lié par pont disulfure avec 1 domaine Ig par chaine + Tyr kinase intracell
La synapse immunitaire
- Formation de la jonction
- Transport des complexes CMH-peptide
- Stabilisation
fct ÉDUCATION THYMIQUE
création LT qui fonctionne et ne sont pas autoréactif au Ag du soi
sélection + vs -
Sélection positive: survie des cellules T dont les RCT reconnaissent les molécules du CMH du soi
Sélection négative: élimination des cellules T qui réagissent trop fortement avec le CMH du soi
Conséquence de la sélection positive et négative: création d’un répertoire de cellules T restreint au CMH mais autotolérant.
Permet aussi de s’assurer que la cellule T exprime un RCT fonctionnel
site de développement des lymphocytes
thymus
maladie si pas de thymus
humain: syndrome de DiGeorge
souris: mutation nude
structure thymus
Les cellules en cours de différenciation dans le thymus sont nommées thymocytes
Le thymus est fait de deux lobes séparés en lobules
2 ZONES : cortex et médulla
-thymocyte (partout mais + cortex): LT en développement qui repose sur cell épith
-cell épithéliale (cortex + médulla): CMH1 et 2 pour éduquer
-macrophage (cortex+médulla) : CMH1 et 2 pour éduquer + phagocyte thymocyte
-cell dendri (jct corticomédullaire + médulla): CMH1 et 2 pour éduquer
Les précurseurs hématopoiétiques qui colonisent le thymus, entrent à la jonction corticomédullaire, reçoivent des signaux par les ligands de Notch (exprimés par les cellules épithéliales) qui se lient au récepteur Notch qu’ils expriment à leur surface cellulaire: provoque l’engagement vers la différenciation en lymphocytes T
Le développement des thymocytes peut être suivi grâce à
l’expression de molécules de surface (CD4, CD8 et CD3)
étape développement thymocyte suivie par molecule
DN1,2,3,4,DP,SP4ou8
4 sous-populations de DN peuvent être identifiées grâce à l’expression des molécules de surface CD44, CD25 et c-kit
CD44:molécule d’adhésion
CD25: chaîne alpha du récepteur à l’IL-2
C-kit:récepteur du facteur de croissance des cellules souches
DN1: prolifèrent afin d’augmenter le nombre de précurseurs des cellules T (très peu de précurseurs colonisent le thymus)
=>44+,25-,kit+
DN2: prolifèrent afin d’augmenter le nombre de précurseurs des cellules T + début du réarragement de la chaîne beta du RCT (D-J) et début du réarrangement des locus gamma/delta
=>44+,25+,kit+
DN3 : arrêtent de proliférer afin d’effectuer le réarrangement complet de la chaîne beta du RCT= expression du pré-RCT + si le réarrangement beta est productif= expression du préTCR et prolifération
=>44 lo, 25+, kit-
DN4: Prolifération
En effet l’entrée en prolifération des DN3 déstabilisent la protéine RAG-2 ce qui mène à sa dégradation. Cela a pour conséquence d’empêcher tout autre réarrangement de chaîne beta; ce phénomène s’appelle exclusion allélique (cela empêche aussi de débuter le réarrangement de la chaîne alpha)
=> toute -
DP: réarrangement alpha=TCR
L’expression de la chaine pré-Talpha est perdue lors de la différenciation en thymocytes DP
Suite à la beta-sélection (expression et signalisation du pré-RCT), le thymocyte DP arrête de proliférer. Ceci stabilise la protéine RAG2 afin de permettre le réarrangement au locus alpha du RCT.
Sélection +/-
SP: La sélection négative continue aussi au stade SP
Ces étapes de sélection sont nécessaires à cause du réarrangement aléatoire des chaines du RCT et du mode de reconnaissance de l’Ag par le RCT
V ou F bcp de précurseurs colonisent le thymus
très peu de précurseurs colonisent le thymus
DN1 prolifère dans thymus!
Analyse cytofluorométrique du développement thymique
bcp de DP
peu de SP: 98% des thymopcytes n’arrivent pas à maturation (sélection + ++++)
temps développement thymocyte
3 semaines
Est-ce qu’un thymocyte DN3 sait que le
réarrangement de la chaine beta est productif (code
pour une protéine fonctionnelle)? Est-ce qu’un thymocyte DN3 qui n’a pas fait un
réarrangement productif de la chaine beta du RCT
poursuivra sa différenciation?
Non x2
Afin de savoir si son réarrangement beta est productif, les DN3 produisent une chaine pré-Talpha invariable. Elle remplacera la chaine alpha du RCT afin de permettre l’expression à la surface cellulaire du pré-RCT (pré-Talpha, chaine beta du RCT et complexe CD3). Ceci n’aura lieu que si le réarrangement beta est productif puisque l’expression du pré-RCT requière la présence de toutes les composantes du pré-RCT.
Structure et fonction du pré-RCT
L’expression du pré-RCT à la surface cellulaire indique au thymocyte qu’un réarrangement productif de la chaîne beta a été effectué. Ce processus s’appelle la beta-sélection.
Ceci ne nécessite pas d’interaction avec un ligand
Les enzymes RAG1 et RAG2 (responsables du réarrangement des gènes du RCT) sont transcrits du stade
DN2 à DP
autres fct du cd4 et cd8 à part augmenter avidité
transduction signal
