Cours 6 Flashcards
Avant l’identification du RCT et de la détermination qu’un fragment peptidique de l’antigène associé au CMH etait reconnu par le RCT, il y avait deux modèles de la reconnaissance antigénique par les cellules T.
Expérience
DEUX RÉCEPTEURS SÉPARÉS, l’un reconnaissant
le CMH et l’autre reconnaissant l’antigène (« double
récepteur »)
UN SEUL RÉCEPTEUR, capable de reconnaître
l’antigène complexé avec une molécule du CMH du Soi (« Soi modifié »)
Dans cette expérience, Kappler et Marrack ont fusionné deux clones de cellules T de spécificité antigénique différentes et de restriction au CMH différents. Un clone est spécifique pour l’antigène OVA et la molécule de classe II I-Ak et l’autre clone est spécifique pour l’antigène KLH et la molécule de classe II I-Af.
Si le modèle du double récepteur (un récepteur reconnaît l’antigène et l’autre le CMH) est vrai, la cellule fusionnée devrait reconnaître l’antigène OVA aussi bien sur des cellules présentatrices d’Ag de CMH IAk ou IAf ainsi que reconnaître KLH sur des cellules présentatrices d’Ag de CMH IAk et Iaf
Si le modèle du soi-modifié (un seul récepteur reconnaît l’antigène et le CMH) est vrai, la cellule fusionnée ne pourra que reconnaître l’Ag OVA sur une cellule présentatrice d’Ag portant le CMH IAk et l’Ag KLH sur une cellule présentatrice d’Ag exprimant le CMH IAf
Les résultats expérimentaux démontrent que le modèle du soi-modifé (ou un récepteur reconnaît l’Ag et le CMH) est vrai.
Identification tardive du RcT p/r aux Ac
Difficultés rencontrées
-Les cellules T devaient posséder un récepteur antigène spécifique et clonotypique
-Récepteur membranaire (pas de forme soluble)
-Interaction plus faible avec l’antigène que les anticorps
-Spécifique pour l’antigène et le CMH = double
EXPÉRIENCE QUI A PERMIS D’ISOLER LE RCT
- Production d’un hybridome T spécifique pour l’Ag ovalbumine (OVA): Immunisation de souris avec l’Ag OVA, attend quelques jours, prélève les ganglions lymphatiques (site de la réponse T), cultive les cellules avec l’Ag OVA afin d’enrichir en cellules T spécifiques pour OVA (seules les cellules spécifiques pour OVA vont proliférer dans ces conditions)
- Fusion avec une lignée de cellules T immortalisées: production hybridomes T
- Clonage par dilution limite afin d’obtenir des hybridomes T dérivant d’une seule cellule T fusionnée. Ceci afin d’avoir des cellules T qui expriment toutes le même RCT)
- Utilise cet hybridome T comme source d’Ag pour tenter d’obtenir des Ac monoclonaux dirigés contre le RCT
- Quelques jours après immunisation, prélève la rate, fusionne avec lignée de cellules B immortalisées, clonage par dilution limite afin d’obtenir des Ac monoclonaux qui reconnaissent l’hybridome T utilisé lors de l’immunisation
6.Sélection et amplification des clones qui sécrètent des Ac qui se fixent aux hybridomes T
- Identification d’un Ac qui lie le RCT en déterminant si l’ajout de l’Ac inhibe la reconnaissance antigénique et donc l’activation de l’hybridome T. La stimulation des hybridomes T se fait en les incubant avec des cellules présentatrices d’antigène chargées avec l’antigène et possédant le bon CMH (cellules jaunes dans le schéma)
- Utilisation de l’Ac monoclonal pour immunoprécipiter le RCT et démontrer qu’il est composé de deux chaines d’environ 45 kDa
structure TCR
Membre de la superfamille des Ig
2 chaine (alpha et beta) possède 2 domaines (variable et ct) contenant chacun un pont di-s intrachaine
Nter variation marquée de la séquence d’un RCT à l’autre: 2domaine variable avec ses 3 régions hypervariables
Proximal à la membrane=2 domaine constant ou C
Région transmembranaire de 21-22 aa, contiennent des résidus chargés positivement, inhabituel pour un domaine membranaire
Courte queue cytoplasmique en Cter
Réarrangement du RCT (recombinaison qui augmente diversité)
Dans la réagion variable (Nter)
chaine alpha=VJ
chaine beta=VDJ
qu’Estce qui est important pour la recombinaison du TCR
seq RSS (même principe que pour Ac)
Afin de positionner les
RSS du même coté de la
double hélice d’ADN afin
de les rendre accessibles à
une même enzyme
23=2 tour
12= 1 tour
structure du RSS du chaine alpha et beta
chaine alpha= V23—12J
chaine beta= V23—12D23—12J
étape de remcombinaison pour VDJ( quel partie en premier)
- DJ en premier
- V se recombine à DJ après
rôle de Rag1/2, Tdt, Artémis et ligase
rag= reconnait RSS et coupe en 2: joint codant et siganl
tdt= ajout n nuclotide
artémis= endonucléase coupe hairpin
ligase= liagation de ADN apres tdt
Seules Rag1, Rag2 et TdT sont spécifiques des lymphocytes. Les autres protéines sont celles qui agissent dans la voie de réparation de l’ADN par jonctions d’extrémités non homologues (NHEJ) et sont donc exprimées par tous les types cellulaires.
étape recombinaison
- HMG Rag1/2 plie adn et apporte segment proche + coupe=cassure simple dans un des brins d’ADN exactement en 5’ de l’heptamère du SSR des segments de gène V et J.
- Trans-estérification. Le groupement 3’OH généré par le clivage de Rag1/2 va attaquer le groupement phosphate de l’autre brin d’ADN (trans-estérification) créant une extrémité en épingle à cheveu au niveau de l’extrémité codante (à coté du segment de gène V ou J; coding end ds le schéma) et une extrémité franche au niveau du bout signal (signal end ds le schéma).
L’extrémité franche de la jonction signal sera liguée pour former un cercle de recombinaison qui sera éventuellement perdu
Étape 3. Ouverture de la structure en épingle à cheveu par Artemis. Notez que cette ouverture peut avoir lieu à différent endroit dans l’épingle à cheveu. Selon l’endroit où l’ouverture sera faite cela créera différentes extrémités (cohésives (overhang ds le schéma) en 5’ ou 3’ ou franches).
Étape 4. Ajout des P-nucléotides. Les extrémités cohésives sont remplies par une polymérase en utilisant l’information du brin complémentaire *seq palindrome
Étape 5. à l’occasion avant que les extrémités soient remplies par la polymérase, il arrive que des exonucléases enlèvent des nucléotides.
Étape 6. Ajout de N-nucléotides ajout de nucléotides de façon aléatoire et indépendante de la matrice d’ADN par l’enzyme Tdt (terminal deoxy transferase)
Étape 7. Ligation des extrémités pour former la jonction codante. Utilises les enzymes classiques de la réparation des cassures d’ADN double brin
Génération de la diversité
Diversité génique (polymorphisme)
Diversité combinatoire (V, D, J).
P-nucléotides (Artemis).
N-nucléotides (TdT).++++++
Activité exonucléase.
Réassortiment des a et des b.
- Pas d’hypermutation somatique.
V ou F. Un LT exprime un seul type de TCR spécifique
Vrai
Exclusion allélique
le réarrangement productif (qui code pour une protéine fonctionnelle) de la chaine alpha ou beta mène à l’arrêt du réarrangement au locus respectif.
qu’est ce qu’on retrouve dans les régions variables du TCR
CDR1,2,3
alpha: 1 et 2 dans V et 3 à la jct VJ
beta: 1 et 2 dans V et 3 à la jct VD et DJ
Quelle région CDR1/2 ou CDR3 possède le plus
de diversité de séquences?Quelle région va être impliquée dans la reconnaissance du peptide antigénique?
3
interaction CDR-CMH
CDR1 et 2 interagissent principalement avec les hélices alpha du CMH
CDR3 interagit avec le peptide
Boucle cdr4 n’interagit pas avec le complexe CMH-peptide
