Cours 3 : La réplication Flashcards
Quelles sont les 4 phases de la division cellulaire
Phase S
Phase G1
Phase G2
Phase M
Quelles phases font parties de l’interphase
S, G1 et G2
Que se passe-t-il lors de la phase M
Mitose et cytokinèse
5 phases de la mitoses
- Prophase (condensation des chromosomes)
- Prométaphase (disparition du noyau)
- Métaphase (Alignement chromosome)
- Anaphase (séparation chromatides soeurs)
- Télophase (décondensation ADN)
Quelles sont les 3 points de contrôle dans le cycle cellulaire
- G1/S : L’environnement est-il favorable
- G2/S : Est ce que tout l’ADN est répliqué, Est ce que tous les dommages sont réparés
- M : est ce que tous les chromosomes sont attachés au fuseau mitotique
Quel est le rôle des cdk et des cyclines
Les cyclines se lient aux Cdk, ce qui les activent et permet la phosphorylation de protéines, ce qui fait progresser le cycle cellulaire
Vrai ou faux : on peut répliquer l’ADN sans ouvrir la double hélice
Faux, Il est nécessaire d’ouvrir la double hélice pour rendre accessible les 2 brins
À quel endroit se fait l’ouverture de la double hélice d’ADN
Aux origines de réplications (ORI)
Combien d’ORI ont les procaryotes vs eucaryotes
Procaryotes : 1
Eucaryotes : plusieurs
Vrai ou faux : tous les organismes possèdent des séquences consensus pour leur ORI
Faux,
Procaryotes : consensus, riche en AT
Eucaryotes : pas de séquence consensus (déterminé par la forme)
À quel phase du cycle cellulaire les ORI s’ouvrent-elles
À la phase S
Quelles sont les 3 fonctions de la protéine initiatrice
- Trouver et lier l’ORI
- Recruter d’autres protéines nécessaires à la réplication (2 hélicases)
- Ouvrir la double hélice (Procaryotes)
Qu’est ce que le réplicateur
L’ensemble complet des séquences suffisantes pour permettre l’initiation de la réplication
Qu’est ce qu’un ORI
Le site spécifique où commence la séparation des 2 brins et la réplication (fait partie du réplicateur)
Quelles sont les 3 étapes de l’ouverture de la double hélice chez les procaryotes
- DnaA (protéine initiatrice) lie spécifiquement les sites 9-mère
- La liaison d’un ATP à DnaA permet l’interaction avec un site 13-mère, ce qui permet la séparation de la double hélice
- DnaA aide à positionner l’hélicase qui poursuivra la séparation de la double hélice
Qu’est ce que l’ORC
Chez les eucaryotes, c’est le complexe de reconnaissance de l’origine de réplication. Il contient 6 protéines
Est ce que la liaison de l’ORC (eucaryotes) aboutit à l’ouverture de la double hélice
Non
Que se passe-t-il pour passer du complexe pré-réplicatif au complexe réplicatif (Eucaryotes)
Activation des cdk qui induit une série de phosphorylation de protéines
Quels sont les 4 éléments qui permettent la reconnaissance de l’ORI chez les eucaryotes
- Séquences riches en AT ou CG
- Structure d’ADN particulière
- Régions libre en nucléosomes
- Régions impliqués dans l’initiation de la transcription (pas bcp de nucléosomes)
Est ce que tous les ORI s’ouvrent en même temps
NON, dépend de l’environnement et des voies de signalisation
Qu’est ce qu’une hélicase
Une enzyme hexamérique en forme d’anneau qui entoure l’ADN simple brin et se déplace rapidement le long de la chaîne
Vrai ou faux : l’hélicase a besoin d’ATP pour se déplacer
Vrai, l’hydrolyse de l’ATP lui permet de se déplacer et entraîne la séparation des brins
L’hélicase a-t-elle une haute processivité
Oui, elle peut catalyser des réactions successives sur une molécule sans la relâcher
Comment la structure de l’hélicase permet-elle de séparer la double hélice
Chaque sous-unité possède une boucle qui agrippe la charpente sucre-phosphate
Les 6 sous unités forcent l’ADN à passer dans le pore central qui ne laisse passer qu’un seul brin : force la séparation de la double hélice
Quel est le rôle des protéines SSB
S’attacher sur l’ADN simple brin après sa séparation par l’hélicase afin de le stabiliser (empêche la formation d’épingle)
Quel est le rôle des topoisomérases
Couper et ressouder le double brin d’ADN pour enlever les supertours et diminuer la tension
Quels sont les 2 types de topoisomérases et leur rôle
Topoisomérase I : coupe et ressoude un des brins d’ADN
Topoisomérase II : coupe et ressoude les 2 brins d’ADN
Qu’est ce que l’oeil de réplication
Formée aux ORI par des hélicases qui ouvrent la double hélice d’ADN (devant : topoisomérase, derrière : SSB). Il y a création d’une fourche de réplication de chaque côté de l’oeil de réplication
Vrai ou faux : la vitesse aux fourches de réplication chez l’homme est beaucoup plus grande que celle chez E. Coli
Faux, la vitesse aux fourches de réplication chez E. Coli est 20 fois plus rapide (réplication complète du génome en 30 minutes)
Quelle enzyme catalyse la synthèse de l’ADN
l’ADN polymérase
De quoi l’ADN polymérase a-t-elle besoin pour commencer la synthèse d’un brin de novo
D’une amorce présentant un 3’-OH libre
Quelle enzyme est responsable de la synthèse de l’amorce
La primase (ARN polymérase)
De quelle manière sont chargés l’Anneau coulissant et l’ADN polymérase à l’amorce d’ARN
L’amorce est reconnu par le chargeur qui, en présente d’ATP, s’y lie et installe un anneau coulissant. Après l’hydrolyse de l’ATP, le chargeur se dissocie et permet la liaison de l’ADN polymérase à l’anneau coulissant
Est ce possible que le chargeur et l’ADN polymérase soient liés en même temps à l’anneau coulissant
Non, ils sont en compétition pour le site de liaison
Quel est le rôle de l’anneau coulissant lors de la synthèse d’un nouveau brin d’ADN
Elle permet de maintenir l’ADN polymérase sur le brin matrice (l’empêche de s’éloigner)
L’anneau coulissant encercle-t-il l’ADN simple brin ou double brin
Double brin, le trou central formé par l’association de clamps est assez grand pour encercler la double hélice sans lui toucher
Pourquoi l’ADN polymérase a-t-elle besoin d’énergie pour synthétiser un nouveau brin
- Rupture du lien avec le premier phosphate pour former le lien phosphodiester avec la chaîne naissante
- Rupture du lien dans le pyrophosphate libéré par la phosphatase
L’ajout de nucléotides lors de la synthèse d’un nouveau brin d’ADN est-il réversible
Non, cet ajout est irréversible (processus couplé : total d’énergie émise = irréversible)
Comment l’ADN polymérase peut-elle différencier les dNTP des rNTP
Grâce à l’exclusion stérique des rNTP du site actif de l’ADN polymérase (pas de place pour le groupement OH)
Qu’est ce que la sélectivité cinétique
N’importe quel nucléotide peut entre dans l’ADN polymérase, mais seulement le nucléotide qui arrive à faire un bon appariement avec le nucléotide de la matrice est dans une bonne position pour permettre la catalyse de son P (adjacent à 3’-OH)
Quels sont les 3 domaines de l’ADN polymérase
- Paume : site catalytique et vérification de l’appariement (sillon mineur)
- Doigts : expose un nucléotide à la fois et referme si bon appariement (Association)
- Pouce : aide à tout retenir ensemble (attachement à la charpente surcre-P)
Que permettent les ions métalliques (Mg2+ et Zn2+) de la paume de l’ADN polymérase
- Favoriser l’interaction entre l’amorce et le nouveau nucléotide en préparant le O à l’attaque
- Stabiliser le pyrophosphate produit en neutralisant les charges négatives
Quelle est l’étape limitante de la haute processivité de l’ADN polymérase et comment diminue-t-on cette limitation
L’attachement de l’ADN polymérase sur l’ADN
Le complexe Clamp maintient l’ADN polymérase sur l’ADN
Comment répare-t-on les erreurs commises par l’ADN polymérase
La paume ralentit la catalyse et l’activité exonucléase permet de dégrader le nucléotide incorrect
Différence entre exonucléase et endonucléase
Exonucléase : ne peut dégrader l’ADN qu’à partir d’une extrémité
Endonucléase : peuvent dégrader l’ADN en cours de chaîne
Comment est synthétisé le brin d’ADN continu vs discontinu
Continu : 1 amorce nécessaire, l’ADN polymérase avance en même temps et dans le même sens que la fourche de réplication
Discontinu : l’ADN polymérase se déplace dans le sens inverse de la fourche créant les fragments d’Okazaki, plusieurs amorces sont requises
Comment l’amorce d’ARN part de l’ADN
- La RNase H dégrade les amorces d’ARN/ADN (retire tous les nucléotides de l’Amorce sauf le dernier)
- Exonucléase 5’ retire le dernier nucléotide
- ADN polymérase peut combler la brèche
- L’ADN ligase attache ensemble 2 fragments d’ADN en reformant une liaison phosphodiester entre 2 nucléotide adjacents
Quels sont les 2 types d’ADN polymérase chez les procaryotes
- ADN polymérase I : substitution des amorces ARN, réparation ADN
- ADN polymérase III : Réplication du chromosome
Quels sont les 3 types d’ADN polymérase chez les eucaryotes
- ADN pol delta : Synthèse brin discontinu, NER et BER
- ADN pol epsilon : synthèse brin continu, NER et BER
- ADN pol Alpha : Synthèse des amorces
Qu’est ce qu’une holoenzyme
Un complexe multi-protéique dans lequel une enzyme noyau est associée à des partenaires qui renforcent son activité
Qu’est ce que le répliosome
Association des ADN polymérases travaillant sur chacun des brins
Comment se fait la coordination de la synthèse des brins d’ADN chez E coli
Complexe protéique (ADN pol III holoenzyme) qui avance dans le sens de la fourche de réplication. Le brin discontinu est plié en boucle pour respecter le sens de la lecture
Qu’est ce qui se retrouve dans le complexe ADN pol III holoenzyme chez E.Coli
2 polymérases retenues ensembles par le Loader qui fournit les clamps au fur et à mesure
L’holoenzyme a des interactions avec l’hélicase
Qu’est ce qui permet de déterminer la taille des fragments d’Okazaki
Les interactions entre l’hélicase et la primase (si les interactions sont fortes, la primase fait plus souvent des amorces et les fragments d’Okazaki sont plus courts)
Que se passe-t-il chez E. Coli lorsqu’un Okazaki est complété par la polymérase
- La polymérase se détache de son Clamp
- Le clamp accueil la Rnase H (enlève l’amorce)
- Une fois l’Okazaki ressoudé, le loader enlève le Clamp de l’ADN
Quelles sont les 4 généralités sur les modèles de répliosomes chez E. Coli
- Brin discontinu forme une boucle
- Les polymérases travaillent de manière coordonnée sur les 2 brins antiparallèles
- Quand l’ADN pol termine la synthèse d’un fragment d’Okazaki, elle se détache de sa matrice
- L’ADN pol reste attaché au répliosome et peut débuter la synthèse d’un nouveau fragment
Comment est le répliosome chez les eucaryotes
3 polymérases distinctes
Le Loader est éjecté pour permettre la liaison de l’ADN polymérase
Les cdk permettent l’assemblage du répliosome
Comment se réassemble les nucléosomes après la synthèse des 2 nouveaux brins
Les anciens nucléosomes sont partagés entre les 2 nouveaux brins
Les clamps recrutent de nouveaux nucléosomes qui s’Assemblent à travers les anciens
Que se passe-t-il avec les histones lorsque le nucléosome est désassembler lors de la réplication de l’ADN
H3-H4 tétramères restent attachés grâce aux protéines chaperonnes et transfert sur un nouvel ADN après la réplication
H2A-H2B quittent et se réassemble après la réplication (compétition avec les nouveaux)
Vrai ou faux : les tétramères d’histones H3-H4 gardent leur place initiale alors que H2A-H2B se retrouvent légèrement déplacés
Vrai
H3-H4 : même séquence d’ADN qu’avant la réplication
H2A-H2B : peuvent se retrouver dans les nucléosomes voisins
Comment les chromosomes circulaires répliqués se séparent-ils
Grâce à la topoisomérase II qui coupe l’ADN double brin
Quelle molécule peuvent résoudre les caténanes lors de la réplication chez les eucaryotes
Les topoisomérases
Quelle extrémité d’un chromosome linéaire ne peut pas être répliqué et pourquoi
l’extrémité 3’ parce que l’ADN polymérase a besoin d’une amorce
Qu’est ce que la télomérase
Une polymérase qui contient un ARN. Elle utilise sa partie ARN comme matrice pour allonger l’extrémité 3’ des chromosomes
Qu’est ce que les télomères
Séquences répétitives qui permettent d’allonger le bout 3’ et d’ajouter un autre fragment d’Okazaki sur le brin 5’
Vrai ou faux : plus le télomère est long, moins la télomérase est active
Vrai, c’est une boucle de rétrocontrôle négative
Comment est formée la T-loop et que permet-elle
- Séquence répétée reconnue par TRF2 qui assure le positionnement du complexe Shelterin
- Les protéines protectrices des télomères (TOP1) peuvent lier la séquence simple brin et former la T-loop
Permet de faire la différence avec un bris d’ADN et d’éviter les réparations
Qu’arriverait-il sans l’Action des télomérases
Un raccourcissement progressif du chromosome à chaque génération cellulaire
Dans quels types de cellules les télomérases sont-elles activent
Cellules souches
Cellules germinales
Cellules cancéreuses
Quels sont les défis du séquençage + solutions (4)
- Savoir comment le faire : méthode de Sanger
- Obtenir l’ADN sous forme manipulable, en petits morceaux : banque génomique
- Capacité à grande échelle : automatisation
- Assembler et annoter les données : bio-informatique
5 étapes du séquençage de l’ADN avec la méthode de Sanger
- Séquence seulement 1 brin : dénaturer l’ADN et gardé 1 brin comme matrice
- Production d’une amorce connue et radiomarquée
- À partir de la jonction amorce-matrice l’ADN polymérase réplique l’ADN
- La réplication est arrêtée avec un ddNTP spécifique connu
- On recommence l’étape 3 et 4 plusieurs fois (toujours avec la même amorce) en arrêtant la réaction avec différent ddNTP
Pourquoi dans le séquençage d’ADN par la méthode de Sanger doit-on séparer l’échantillon en 4 tubes
Pour séparer selon quel ddNTP est utilisé pour arrêté la réaction (les tubes contiennent aussi l’ADN polymérase et des dNTP normaux)
Comment peut on reconstituer une séquence d’ADN à la main par la méthode de Sanger
En faisant une électrophorèse des 4 tubes
Quel sont les 2 problèmes de la méthode de Sanger (à la main) et quelles sont les solutions
- En 2 jours de travail, séquençage de 500 pb : Automatisation de la méthode
- Il faut segmenter l’ADN en multiples petits fragments exploitables : Construction d’une banque génomique
Comment a-t-on construit la banque génomique
- ADN isolée et fragmentée (coupée par des enzymes de restrictions)
- Fragments insérés dans un vecteur plasmidique
- Vecteurs transférés dans des bactéries (multiplication de façon indépendante)
Quelles améliorations de la technique de Sanger ont permis la construction de séquenceurs
- Séparation des fragments d’ADN par chromatographie sur colonne
- Les ddNTP sont remplacés par des ddNTP fluorescents
Comment sont lus les résultats du séquençage par un séquenceur
Les fragments polymérisés sortent de la colonne (du plus petit au plus grand) et chaque fragment émet une couleur différente selon ddNTP-fluo
Comment fait-on l’assemblage des fragments qui ont été séquencés
on utilise les séquences superposés pour déterminer l’ordre dans lequel les fragments doivent être placés
Qu’est ce qui rend le processus d’assemblage des séquences du génome plus difficile
La présence de régions répétées
Qu’est ce que la PCR
Technique utilisé pour produire une grande quantité de copies d’une séquence d’ADN précise
Quelles sont les 3 étapes de la PCR
- Le double brin est ouvert par dénaturation à une haute température
- Les amorces sont hybridées à l’ADN à une température plus basse
- L’ADN pol utilisée est résistante au haute température (entre Tdénaturation et Thybridation)
De quoi dépend le nombre de produit du PCR (nb de molécules finales déterminées par les amorces)
- Nombre de cycles
- Nombre de molécules initiales d’ADN servant de matrice
- Quantité de réactif
Applications PCR + séquençage
- Identification de polymorphisme (différentes allèles d’un gène)
- Diagnostique d’infections (identifier présence virus/bactéries dans l’organsime)
- Diagnostique anténataux
Applications RT + PCR + électrophorèse
- PT-PCR : Permet de détecter l’expression de gène dans différents tissus (qualitatif)
- gPCR : Marqueur fluo qui permet de suivre le niveau d’amplification de l’ADN en temps réel (quantitatif)
Comment la PCR peut-elle être utile lors de la mutagenèse
En utilisant des amorces porteuses de mutations, on peut savoir si notre mutagenèse a fonctionnée
