Cours 13 Flashcards
Quels sont les principes de base du clonage moléculaire ?
- Intègrer ADN dans un vecteur de clonage (un réplicon)
- Pénétrer cet ARN recombinant dans un hôte
- Hôte permet entreposage + réplication de la séquence d’ADN d’intérêt
Qu’est-ce qu’un réplicon ?
Unité de réplication formé par une molé ADN qui peut se répliquer de facon autonome dans un cellule. Chez bact, un réplicon = molé ADN et possède un ORI.
- exemple : plasmides, chromobactériens, ADN bactériophages.
- plasmide souvent utilisé (son ADN) pour la réplication = VECTEUR DE CLONAGE)
Comment on fabrique de l’ADN recombiné in vitro ?
On prend un vecteur plasmidique, que l’on clive avec une endonucléase de restriction et on insère le fragment à cloner avec une ADN ligase –> ADN recombiné.
Quels sont les trois types de clones ?
1-Colonie (clone microbiologique)
2-Fragment cloné (l’insertion)
3-plasmide recombinant
Qu’est-ce qu’un cosmide ?
vecteur plasmidique avec des extrémité cohésives (cos). Permet le clonage de fragments plus gros que ceux que dans lambda (comme phage P1, BAC et YAC aussi)
Quel est une banque de clone d’ADN génomique et son fonctionnement ?
- Ensemble de clones contenant toutes les séquences d’ADN du génome en petits fragments.
- Coupe génome en fragment, intègre fragments dans vecteurs, entrepose dans des hotes.
- = ensemble microtubes contenant chacun un clone différent
Quel est une banque de clones d’ADNc ?
Ensemble de clones représentant toutes les espèces ARNm dans la cellule en question. (complémentaire). ADNc contient mm info que ARNm. –> seulement les exons du gène. ARNm en transcription inverse.
- fonctionnement : Synthèse 1er brin adnc + transcriptase inverse à parti oligo-t, traitement à la Rnase pour couper le brin ARN (Nick translation), puis synthese du second brin d’ADNc (avec ADNpol+dNT+ADN ligase)
- ici on a juste les séquences exoniques
Que signifie faire un criblage ?
- On peut cribler des banques d’ADNc pour ainsi trouver le ou les clones comportant une séquence d’intérêt avec des sondes spécifiques.
- Identification + tri de clones.
Quelle est une sonde moléculaire ?
- Est une moléculaire d’ADN ou ARN. Marquée ^pour qu’elle soit facilement identifiable et permet de reconnaître (par hybridation) une molé ADN ou ARN qui a une séquence complémentaoire.
- la sonde est tjrs monocaténaire quand on l’utilise. Si elle est en bicaténaire, il faut d’abord la dénaturer.
Comment peut-on isoler un gène ?
1-partir de la protéine pour remonter au gène : STRATÉGIE HISTORIQUE
2-partir de la position du gène sur la carte génétique pour cloner le gene et identifier ensuite la prot : CLONAGE POSITIONNEL
Quel est la stratégie historique pour isoler un gène ?
-On part de la protéine pour remonter au gène.
1-cloner un plasmide ou chez Lambda l’ADNc a l’ARNm du gène dinteret (identifier clones par hybridation de colonie avec sonde ou bien par immunologie)
2-Clonage de l’ADN génomique avec gene intéret chez lambda (ADNc sert de sonde)
3-Sous-cloner avce le transfere dans un autre type de vecteur chez un plasmide l’ADN génomique
4-Séquences clonées pour analyse ou synthese de la prot
Comment fonctionne le séquencage par la méthode de Sanger (méthode manuelle) ?
voir fascicule p61
-ddNTP : nucléotides terminaux avec ATCG.
Comment fonctionne la méthode de Sanger automatisée (1e géné) ?
-Dénaturatio, annealing, extension, produits. Réactions dans un seul tube par électrophorèse par capillaire.
1-fragmentation de l’ADN
2-Clonage dans un vecteur plasmidique
3-Séquencage cyclique
4-Séparation par électrophorese en capillaire
5-Lecture avec étiquettes fluo
Comment fonctionne la méthode de Sanger de 2e génération (cyclic array) ?
1-fragmentation de l’ADN
2-Ligation adaptateurs aux extrémités des fragments
3-obtention dune matrice de polonie
4-Extension enzymatique avec nucléotides marqué aux colorants fluo
5-Lecture cyclique par imagerie de la matrice
Comment fonctionne la plate-forme Illumina ?
Les bases portent des étiquettes colorées + les nucléotides sont des terminateurs réversibles. Marqué au fluor + a un bloqueur
