Cour 12 - Méthodes de dosage des hormones Flashcards
Décrire les différentes familles de structure moléculaire des hormones (3)
Décrire un peu plus largement la dernière catégorie.
- Peptides et protéines ± 360 dA - dizaine kDa
- Stéroides et dérivés ± 300 Da
- Autres:
Dérivés d ’acides aminés»_space;> T4 et T3, catécholamines, sérotonine, épinéphrine
Dérivés d ’acide nucléique»_space;> cAMP
± 200 daltons
Les hormones : nature chimique
- Peptides et protéines
Quel range de taille en kDa?
TRH (Thyrotropin-releasing hormone) 359.5 Da
hCG, Gonadotrophine chorionique humaine 36.7 kDa
Les stéroides sont des molécules qui partagent toutes le même squelette de base: le noyau stérol
Dessine en un.
Précurseur de la vitamine D est le?
Cholestérol
Variations et transformations de structure
Modifications post-traductionnelles
Gly________, sia_______, p___________
Pré___ et pr_________
Disp________ d’une ____-u___
Di_____, mac__________
Formes par_________ mé________ (o_____)
Formes co_______ (_______, gl_________…)
Formes l____ ou l____ à des p________
Variations et transformations de structure
Modifications post-traductionnelles
Glycosylation, sialylation, phosphorylation
Prépro et prohormones
Disproportion d’une sous-unité
Dimères, macrohormones
Formes partiellement métabolisées (oxydée)
Formes conjuguées (sulfatée, glucuronidée…)
Formes libres ou liées à des protéines
Quel sont des considérations cliniques importantes à prendre en compte chez le patient avant le dosage? (8)
- Sexe
- Âge:
-Période de la croissance rapide
-Évolution puberté (échelle de Tanner)
-Ménopause/Andropause - Cycle nycthéméral»_space;> Heure du prélèvement
- Cycle menstruel
- Ovulation, grossesse, allaitement
- Niveau de stress
- Aliments:
À jeun ou après repas
Restrictions alimentaires à considérer - Médicaments:
Hormonothérapie de remplacement
Autres Rx, restrictions à considérer
Autres produits en vente libre ou interdits
Hormone total vs libre
Pour quel genre de molécule de quel taille?
Activité biologique est proportionnelle à?
Influence hépatique?
Demie-vie?
Pour les petites molécules avec transporteurs comme les stéroïdes et T4/T3.
La concentration de l’hormone libre dans le sang et non à celle de l’hormone liée. Notion de fraction biodisponible
Influence hépatique sur la synthèse des transporteurs et sur la concentration de l’hormone totale.
Demie-vie plus longue des fractions liées
Pré analytique; sang; prélèvement
Sérum; tubes utilisés? Hormone pélevé?
Plasma; tubes utilisés? Hormone pélevé?
Détail additionels plasma? (2 et demi)
Sérum: Tube rouge (vide) ou or (gel séparateur+silice)
Hormones thyroïdiennes
Hormones stéroïdiennes
Hormones protéiques stables
Plasma: Tube lavande (EDTA Na/K)
Hormones peptidiques (plus fragiles)
Tube prérefroidi
Éch conservé sur glace + stabilisé sans délai (<30 min)
Au besoin, ajouter inhibiteur de protéase sans délai
Pré analytique; Urine; prélèvement
Sur une miction (dépistage, test qualitatif)
Sur une collecte de 24 heures (quantitatif / jour)
-Reflet de la c_________ s_______ m________
Pré analytique; Urine; prélèvement
Sur une miction (dépistage, test qualitatif)
Sur une collecte de 24 heures (quantitatif / jour)
-Reflet de la concentration sérique moyenne
Pré analytique; Salive; prélèvement
Prélèvement f_____ et n__ i_______
Reflet de l’________ li____ dans le s____.
(ex.:cortisol et autres stéroïdes)
Mais exige une méthode plus s________ car fa______ concentrations.
Pré analytique; Salive; prélèvement
Prélèvement facile et non invasif
Reflet de l’hormone libre dans le sang.
(ex.:cortisol et autres stéroïdes)
Mais exige une méthode plus sensible car faibles concentrations.
Plus la Ka est _______, plus l’Ac a de l’______ pour l’Ag, plus il se lie rapidement et complètement, et par conséquent, moins il permet la liaison avec d’autres a_______ ou pr_______.
Lorsque l’affinité de l’anticorps est grande, la sensibilité et la spécificité de l’immunoessai s’__________ et les effets de matrice sont _________.
Plus la Ka est élevée, plus l’Ac a de l’affinité pour l’Ag, plus il se lie rapidement et complètement, et par conséquent, moins il permet la liaison avec d’autres antigènes ou protéines.
Lorsque l’affinité de l’anticorps est grande, la sensibilité et la spécificité de l’immunoessai s’améliorent et les effets de matrice sont moindres.
Dans les immunoessais, la formation de la composante AgAc (antigène-anticorps) peut être quantifiée directement par:
- Visualisation de la p__________ du complexe immun formé.
- En mesurant la l_________ d_________ (néphélémétrie) ou a________ (turbidimétrie) par les complexes immuns formés.
- Visualisation de la précipitation du complexe immun formé.
- En mesurant la lumière dispersée (néphélémétrie) ou absorbée (turbidimétrie) par les complexes immuns formés.
Immunoessai compétitif 1 Anticorps en une étape
Qu’est-ce qui est fixe?
Qu’est-ce qui est limitant?
Proportionalité?
Fixe = Anticorps, Ag marqué
Limitant = Anticorps
Mesure de Ac-Ag* est inversement proportionnelle à la concentration de l’Ag à doser. Important pour la biotin car elle t’amène à surestimer tes résultats si en excès.
Immunoessai compétitif 1 Anticorps en 2 étapes
Saturation séquentielle
Qu’est-ce qui est fixe?
Qu’est-ce qui est en excès?
Se fait en deux étapes, quelle sont-elles?
Fixe = Anticorps, Ag marqué
Excès = Anticorps et Ag marqué
1) Ag présenté à un excès d ’Ac (l’échantillon)
2) Ag* ajouté en excès pour saturer les sites laissés libres et compétitionner avec Ag lié.
Essai immunométrique (2 Anticorps) «Sandwich »
Qu’est-ce qui est fixe?
Qu’est-ce qui est en excès?
Proportionalité?
Fixe = Anticorps-fixé et Anticorps marqué
Excès = Anticorps-fixé et Anticorps marqué
La mesure des complexes Ac-Ag-Ac* est directement proportionnelle à la concentration de l’Ag à doser
Essai immunométrique (2 Anticorps) «Sandwich »
Qu’est-ce que l’effet crochet?
Donne un résultat faussement…
Solution?
Les 2 anticorps sont saturés d’antigène
Donne un résultat faussement sous-estimé malgré une conc réellement élevée de l’Ag (hormone).
Diluer l’échantillon jusqu’à l’obtention de résultats cohérents observés sur des dilutions différentes.
Quel sont les 4 molécules signal ou marqueurs pour les Ac?
Lesquels (2) se prête le mieux à l’automatisation? Le plus populaire?
RIA = Radioimmunoassay
EIA = Enzymatic immunoassay
CIA = Chemiluminescent immunoassay
FIA = Fluorophore immunoassay
CIA & FIA
CIA le + populaire en automatisation
Quelle sont les stratégies pour séparé l’hormone libre des hormones liés? (3)
Anticorps de capture lié à une phase solide
– paroi d’un tube ou d’un puits de microplaque
– bille à haute densité
– bille magnétique
Utilisation d’un agent précipitant ou d’un deuxième anticorps.
Utilisation d’un pont avidine-biotine.
Quelle sont les stratégies pour estimé l’hormone libre? (4)
Laquelle est un ‘‘gold standard’’
- Technique par dialyse à l’équilibre+ultrafiltration
(Gold Standard) - Technique par immunoessai compétitif (1 ou 2 étapes)
- Technique par calcul
- Technique par précipitation NH2SO4
Donne la fraction biodisponible (libre+albumine) de la SHBG
Quel analyte demeure une estimation dites très imparfaites?
T4 (thyroxine) libre
Essais non immunologiques
Trois grandes catégories
- Essais biologiques: ex.: induction hormonale
- Essais utilisant des récepteurs ou protéines liantes
- Chromatographies
Sensibilité: (VP / (VP + FN)) *100
Veux dire quoi?
Spécificité: (VN / (FP + VN)) * 100
Veux dire quoi?
Sensibilité → Détecte bien
↑ = Identifie la majorité des vrai positifs
↓ = Bcp de faux négatifs
Spécificité → Discrimine bien
↑ = Identifie la majorité des vrai négatifs
↓ = Bcp de faux positifs
Exactitude
Veux dire quoi?
Incertitude (%) =
(valeur _______– valeur _____) / valeur _____x 100
CV = ?
Comparaison du résultat d’un seul dosage d’un échantillon inconnu à une valeur cible consensuelle.
L’exactitude est donc généralement évaluée à partir des contrôles de qualité externes.
Incertitude (%) =
(valeur obtenue – valeur cible) / valeur cible x 100
CV = écart type / moyenne x 100
Erreur totale des dosages
La plupart des tests endocriniens ont une imprécision (CV) de _ à __% pour les valeurs ________ ou _________.
Cette imprécision double souvent pour les valeurs à la limite _________ de la normale.
Le biais entre les méthodes est parfois tel que les résultats peuvent être di____________ c__________ entre différents laboratoires (différentes méthodes).
Erreur totale des dosages
La plupart des tests endocriniens ont une imprécision (CV) de 5 à 15 % pour les valeurs normales ou élevées.
Cette imprécision double souvent pour les valeurs à la limite inférieure de la normale.
Le biais entre les méthodes est parfois tel que les résultats peuvent être difficilement comparés entre différents laboratoires (différentes méthodes).
Limit of Quantitation (pas de question ici)
LoQ is the lowest concentration at which the analyte can not only be reliably detected but at which some predefined goals for bias and imprecision are met. “Functional sensitivity” is defined as the concentration that results in a CV= <20% (or some other predetermined % CV), and is thus a measure of an assay’s precision at low analyte levels (without addressing bias).
Donc un CV vraiment haut les données sont vraiment bcp dispersé et on veux pas ca. Alors est-ce que les données que tu mesure sont vraiment informative sur la vrai valeur de conc de l’analyte? Non alors tu veux garder ton CV raisnoablement bas (habituellement <20%).
Limit of Quantitation
LoQ is the lowest concentration at which the analyte can not only be reliably detected but at which some predefined goals for bias and imprecision are met. “Functional sensitivity” is defined as the concentration that results in a CV= <20% (or some other predetermined % CV), and is thus a measure of an assay’s precision at low analyte levels (without addressing bias).
Donc un CV vraiment haut les données sont vraiment bcp dispersé et on veux pas ca. Alors est-ce que les données que tu mesure sont vraiment informative sur la vrai valeur de conc de l’analyte? Non alors tu veux garder ton CV raisnoablement bas (habituellement <20%).
La limite inférieure de détection (LoD) d’une technique est la plus
________ concentration que l’on peut s____________ distinguer du bruit de fonds (ou de la valeur zéro).
La limite inférieure de détection (LoD) d’une technique est la plus
petite concentration que l’on peut statistiquement distinguer du bruit de fonds (ou de la valeur zéro).
Interférences dans les essais hormonaux
- Ré______ cr_____
- An______ h_______ et a___-a_______
- Ma______ des a_______
- Int_________s avec le sy_______ i________r
- Ef___ de m_____
- Réactivité croisée
- Anticorps hétérophiles et anti-animaux
- Masquage des antigènes
- Interférences avec le système indicateur
- Effets de matrice
Interférences dans les essais hormonaux
Réactivité croisée c’est quoi?
Hétérogénéité moléculaire c’est quoi?
Peut-être contourné avec quelle technique?
Capacité de molécules DISTINCTES de réagir avec un même anticorps.
ex: TSH, FSH, LH, hCG (via leur sous-unité alpha)
Capacité de molécules de formes modifiées de réagir avec un même anticorps. ex: prolactine, dimère de PRL, macro-PRL
HPLC
Anticorps hétérophile survient comment/ou?
Interfère dans quel type d’essai?
Affinité?
Anticorps anti-animaux survient comment/ou?
Interfère dans quel type d’essai?
Affinité?
Comment peut-on gérer cette interférence?
Comment sa donne du faux positif?
Comment sa interfère du faux négatifs?
Des anticorps naturels non spécifiques présents chez tous les individus. Certains types sont associés à des maladies autoimmunes.
Interfère surtout dans les essais immumétriques (2 Ac).
Basse affinité.
Des anticorps spécifiques produits chez des individus après exposition à des préparations d’origine animale ou suite à un
contact prolongé avec des animaux.
Interfère dans tous les types d’essais immunologique.
Haute affinité.
Peux ajouter des protéines sériques de même source animale.
FP = Crée un peu entre les deux anticorps
FN = Bloque le site de liaison de l’antigène
Fréquence des interférences hétérophiles sont très rares, de l’ordre de ____ %.
Fréquence des interférences hétérophiles sont très rares, de l’ordre de 0.05 %.
Comment dépister l’interférence provenant d’un Ac hétérophile?
- Dépisté l’erreur
1.1 R_____ inco_____ avec la c______ (_________)***Important
1.2 Dil______ s_____ qui ne conc______ pas (_____)
1.3 Diff______ avec une a____ t_________ - Confirmer le b___ r______
→ R______ a_______ conforme à la c_______ - Éli______ l’in__________
→ Te_______ phy______ ou a____ blo______
- Dépisté l’erreur
1.1 Résultat incohérent avec la clinique (CLINICIEN)
1.2 Dilutions sériées qui ne concordent pas (LABO)
1.3 Différence avec une autre technique - Confirmer le bon résultat
→ Résultat alternatif conforme à la clinique - Éliminer l’interférence
→ Techniques physiques ou agents bloquants
Comment éliminer les interférences hétérophiles (3)
- Élim…..
- Blocage….
- Blocage….
- Élimination des Ac avant dosage
- Blocage non-spécifique des Ac pendant le dosage
- Blocage spécifique des Ac pendant le dosage
Comment éliminer les interférences hétérophiles
- Élimination des Ac avant dosage
Ultra_________, protéine _ ou _, cha____ à __°C, TCA, éth____ ou polyé______ gl____. - Blocage non-spécifique des Ac pendant le dosage
Glo_____ non-i_______, s____ a____ (≥ 2 es____) ou dil____ sé____ avec ces mélanges - Blocage spécifique des Ac pendant le dosage
Il y en as 3 ici.
- Élimination des Ac avant dosage
Ultracentrifugation, protéine A ou B, chauffage à 90°C, TCA, éthanol ou polyéthylène glycol. - Blocage non-spécifique des Ac pendant le dosage
Globulines non-immunes, sérum animal (≥ 2 espèces) ou dilutions sériées avec ces mélanges - Blocage spécifique des Ac pendant le dosage
Immunoglobulines anti Ac hétérophiles
Human Anti-Mouse Antibody
IgG monoclonales de souris anti IgM humaines
Interférences avec le système indicateur (signal) (6)
- Radi…
- Augme….
- Anti….
- Substances f…
- Substances a…
6.
- Radioactivité dans le spécimen
- Augmentation pathologique de l’enzyme utilisée dans un EIA
- Anticorps anti-ruthénium (ECLIA / Roche)
- Substances fluorescentes ou atténuantes dans les FIA
- Substances atténuantes dans les CIA
- Biotine
Biotin
Petites molécules
Test associé? Nb Ac?
Erreur sous forme de +/-?
Grosse molécule
Test associé? Nb Ac?
Erreur sous forme de +/-?
Biotin
Petites molécules
1 anticorps (Compétitif)
Surestimation
Grosse molécule
2 anticorps (immunométrique)
Sous-estimation
Utilisations pharmacologiques de la biotine:
Déf_____ g_____ en bio_______
Mal_____ mé____ mi_________
Mal____ des no_____ cen_____
Cra______ chez les hé_________
Sc_______ en pl_____ évo_____
Sy_______ de ma_________
Nu_______ par_______ totale
Utilisations pharmacologiques de la biotine:
Déficience génétique en biotinidase
Maladies métab. mitochodriales
Maladies des noyaux centraux
Crampes chez les hémodialysés
Sclérose en plaque évolutive
Syndromes de malabsorption
Nutrition parentérale totale
4 analytes ou il y a surestimation du à des hautes doses de biotin
Ac. Anti-récepteur de la TSH (TRAb)
Oestradiol
T3 libre
T4 libre
Effets de matrice
Modifications pouvant affecté le milieu et créée l’effet (5)
Limite quoi?
Compromet souvent quoi?
pH
Force ionique
Concentration
Variété de protéines
Présence de lipides
Limite l’utilisation des trousses sériques avec d’autres milieux (urines, liquides extra-cellulaires variés)
Compromet souvent la mesure exacte de taux élevés mesurés après dilution (nature du diluant)
Interférence par les tubes de prélèvement (Silwet L-720)
Interférence par un surfactant qui tapisse l’intérieur des tubes de
plastique. (provoquerait la désorption des anticorps…).
