Chapitre 4.3 Flashcards
c’est quoi les 2 techniques efficaces pour détecter une séquence d’ARN ou ADN qui combine la séparation sur gel et l’hybridation à une sonde
1) un transfert de type southern (ADN)
2) un transfert de type Northern (ARN)
c’est quoi le transfert de type southern (5 étapes)
1) cliver le génome avec enzymes de restriction
2) migration des fragments dans un gel
3) transfert des fragments sur un filtre de nitrocellulose ou nylon
4) incuber le filtre avec une sonde d’acide nucléique spécifiquement marquée
5) révélation par autoradiographie
est-ce que le southern est utilisé de manière quantitative?
non, c’est plutôt pour voit si la séquence d’interet est présente ou non
c’est quoi le transfert de type northern (5 étapes)
1) dénaturation par formaldéhyde des ARN cellulaires totaux
2) migration sur gel à électrophorèse
3) transfert sur un filtre de cellulose/nylon
4) exposer le filtre à une sonde d’ADN radioactive/fluorescente
5) comparaison des quantités d’ARNm dans les cellules à différentes conditions en applicant des Ac
Pourquoi dénaturer les ARN totaux avec la formaldéhyde pour un northern
pour éliminer les liaisons H entre les paires de bases pour avoir une conformation linéaire qui est plus accessible aux sondes
utilité en général southern vs northern
southern veut identifier une séquence spécifique dans un mélange de fragements vs northern qui veut déterminer quand et à quelle fréquence un gène est exprimé dans l’organisme
est-ce que le northern est utilisé de manière quantitative
oui, de manière semi-quantitative
c’est quoi le transfert de type Western
technique de détection de protéines spécifiques par séparation par électrophorèse et anticorps spécifiques
quelle est la différence entre un western direct et indirect
direct=juste utilise l’Ac primaire
indirect=utilise Ac primaire et après un Ac secondaire conjugé à l’HRP
c’est quoi l’analyse par micropuce d’ADN
analyse qui permet d’analyser l’expression de miliers de gènes dans une seule expérience. Semblable à next gen sequencing
Comment effectuer une analyse par microppuce d’ADN
on a une plaque avec des puits qui contiennent des sondes spécifiques dans chaque puit qui sont fixés à la surface d’une lamelle microscopique de verre.
l’ARNm ou cDNA sont marqués avec un fluorophore (différent pour chaque) et ensuite les 2 conditions sont déposés dans chacun des puits/lamelles pour voir le profil d’expression
c’est quoi le gel à retardement
technique qui étudie l’interaction entre un acide nucléique et une protéine (usually les FT fonctionnels) dans un gel NON-dénaturant
est-ce que le gel à retardement est quantitatif
oui mais seulement semi-quantitatif
c’est quoi un shift et un supershit
shift= protéine+ADN car migre moin rapidement que l’ADN alone
supershift=protéine+ADN+Ac
pourquoi il y a un shift avec protéine+sonde marquée+ADN compétiteur non spécifique et pas de shift quand c’est la même chose mais avec l’ADN compétiteur spécifique
avec non-spécifique= l’ADN est non spécifique donc il ne va pas lier sur la protéine. L’ADN marqué va lier sur la protéine comme d’habitude
avec spécifique= l’ADN spécifique qui n’est pas marqué va lier sur la protéine et techniquement va avoir un shift mais à cause que la sonde est pas marquée, on ne va pas voir le shift
