Chapitre 3.1-Polymérases et PCR Flashcards
quels sont les 2 composantes importantes pour l’initiation de la réaction polymérase par Taq
1) un bout OH 3’ libre sur une amorce
2) ions de Mg
à quelles températures la Taq polymérase est à son activité maximale
entre 75°C et 80°C
c’est quoi les 4 ADN polymérases thermosensibles les plus populaires qui sont utilisés pour la PCR
Taq, Pfx, Pfu et Vent
c’est quoi les caractéristiques de Taq
n’a pas d’activité exonucléase (peut pas corriger des erreurs) et sa demi-vie à 95°C est 1.6h
C’est quoi les caractéristiques de Pfu et Pfx
ont une activité exonucléase (peuvent corriger des erreurs) et contiennent la plus haute fidélité des ADNpoly thermostables
C’est quoi les caractéristiques de Vent
a une activité exonucléase (peut corriger des erreurs) et demi vie à 95°C est de 7h
c’est quoi la fidélité enzymatique
le taux d’erreur pendant l’activité polymérase dans la séquences d’ADN. ADNpoly sans activité nucléase ont des taux d’erreurs plus élévés
quel est l’ordre des meilleures ADNpoly thermosensible en terme de taux d’erreur
Pfu best taux d’erreur, then Vent, then Taq worst taux d’erreur
4 composantes nécessaires pour effectuer la réaction de PCR (substrats nécessaires)
1) ADN matrice à amplifier
2) ADN polymérase thermosensible
3) nucléotides (A,T,G,C)
4) amorces
c’est quoi les 3 étapes de la réaction PCR (en général)
1) dénaturation
2) hybridation
3) polymérisation
c’est quoi l’étape de la dénaturation en PCR
c’est quand le double brin est dénaturé et séparé en simple brins à une haute température de 95°C
c’est quoi l’étape d’hybridation en PCR
quand les amorces d’ADN d’ajoutent sur le simple brin de l’ADN matrice par complémentarité. se passe à 55°C
c’est quoi l’étape de polymérisation en PCR
quand l’ADN polymérase thermosensible s’ajoute à l’OH 3’ libre pour la synthèse du brin d’ADN complementaire à l’ADN matrice. Se passe à 72°C et le temps dépend du # de kb de la séquence
c’est quoi l’amplicon
le fragement amplifié par PCR
Où l’amorce anti-sens va lier?
au bout 3’ du brin sens de l’ADN
où l’amorce sens va lier?
au bout 3’ du brin anti-sens de l’ADN
Pourquoi est-il important d’avoir une quantité suffissante d’ADN matrice?
car si on a pas assez, il n’y aura pas d’amplification. Si on a trop, on va avoir des signaux non-spécifiques
c’est quoi les 2 composantes et leur utilité dans le tampon de PCR 10X
1) tris-Cl: sert à tamponner le milieu réactionnel pour optimiser activité de la Taq polymérase
2) MgCl2: pour avoir ions Mg2+ pour faciliter et stabiliser l’hybridation
3 options pour choisir la température d’hybridation
Calculer le Tm avec la formule :
Tm=4°Cx(#G+C)+2°Cx(#A+T)
Ou choisir le Tm le plus bas pour des amorces avec différents Tm
Ou par essai erreur en commencant avec 54°C
3 critères importants à considérer lors d’un design d’un amorce
1) accessibilité de la région d’amorçage
2) amorçage non-spécifique
3) formation de structures entre les amorces (hairpin, homodimères ou hétérodimères)
3 caractéristiques recommendés pour le design d’une paire des amorces
1) 50% GC
2) G ou C en 3’
3) un Tm rapproché pour les 2 amorces
Comment visualiser l’ADN après la réaction de PCR
avec l’électrophorèse sur gel
comment l’ADN migre sur le gel à électrophorèse
l’ADN est chargé négativement à un pH neutre et donc va migrer vers l’électrode positive quand le gel est submergé dans un tampon qui passe le courant électrique
Comment les bandes du gel d’électrophorèse sont visualisés
avec un intercalant d’ADN fluorescent ou de BrEt qui vont marquer les bandes lorsque le gel est illuminé par les rayons UV
incovenient du bromure d’éthidium
c’est toxique et mutagène
3 applications du PCR
1) caractérisation moléculaire
2) clonage par PCR
3) Quantification moléculaire
comment on determine la longeur du fragement amplifié par PCR sur un gel
en le comparant avec l’échelle de PM
c’est quoi les minisatelites et leur utilité
régions dans l’ADN qui sont repetées en tandem (différent pour chaque personne). Utilisées pour faire les empreintes d’ADN
Pourquoi on utilise le nested PCR
quand on veut détecter des régions d’ADN de faibles concentrations comme l’ADN viral
c’est quoi le principe en général pour le nested PCR
on utilise 4 amorces (2 paires=1 paire externe et 1 interne) pour amplifier l’amplicon du PCR normal
c’est quoi les étapes pour le nested PCR
1) amplifier une séquence comme du PCR normal avec des amorces externes pour les 10 premiers cycles
2) 2eme amplification avec les amorces internes pour 25 cycles
