Chapitre 3.1-Polymérases et PCR

Question 1

quels sont les 2 composantes importantes pour l’initiation de la réaction polymérase par Taq

Answer 1

1) un bout OH 3’ libre sur une amorce
2) ions de Mg

Question 2

à quelles températures la Taq polymérase est à son activité maximale

Answer 2

entre 75°C et 80°C

Question 3

c’est quoi les 4 ADN polymérases thermosensibles les plus populaires qui sont utilisés pour la PCR

Answer 3

Taq, Pfx, Pfu et Vent

Question 4

c’est quoi les caractéristiques de Taq

Answer 4

n’a pas d’activité exonucléase (peut pas corriger des erreurs) et sa demi-vie à 95°C est 1.6h

Question 5

C’est quoi les caractéristiques de Pfu et Pfx

Answer 5

ont une activité exonucléase (peuvent corriger des erreurs) et contiennent la plus haute fidélité des ADNpoly thermostables

Question 6

C’est quoi les caractéristiques de Vent

Answer 6

a une activité exonucléase (peut corriger des erreurs) et demi vie à 95°C est de 7h

Question 7

c’est quoi la fidélité enzymatique

Answer 7

le taux d’erreur pendant l’activité polymérase dans la séquences d’ADN. ADNpoly sans activité nucléase ont des taux d’erreurs plus élévés

Question 8

quel est l’ordre des meilleures ADNpoly thermosensible en terme de taux d’erreur

Answer 8

Pfu best taux d’erreur, then Vent, then Taq worst taux d’erreur

Question 9

4 composantes nécessaires pour effectuer la réaction de PCR (substrats nécessaires)

Answer 9

1) ADN matrice à amplifier
2) ADN polymérase thermosensible
3) nucléotides (A,T,G,C)
4) amorces

Question 10

c’est quoi les 3 étapes de la réaction PCR (en général)

Answer 10

1) dénaturation
2) hybridation
3) polymérisation

Question 11

c’est quoi l’étape de la dénaturation en PCR

Answer 11

c’est quand le double brin est dénaturé et séparé en simple brins à une haute température de 95°C

Question 12

c’est quoi l’étape d’hybridation en PCR

Answer 12

quand les amorces d’ADN d’ajoutent sur le simple brin de l’ADN matrice par complémentarité. se passe à 55°C

Question 13

c’est quoi l’étape de polymérisation en PCR

Answer 13

quand l’ADN polymérase thermosensible s’ajoute à l’OH 3’ libre pour la synthèse du brin d’ADN complementaire à l’ADN matrice. Se passe à 72°C et le temps dépend du # de kb de la séquence

Question 14

c’est quoi l’amplicon

Answer 14

le fragement amplifié par PCR

Question 15

Où l’amorce anti-sens va lier?

Answer 15

au bout 3’ du brin sens de l’ADN

Question 16

où l’amorce sens va lier?

Answer 16

au bout 3’ du brin anti-sens de l’ADN

Question 17

Pourquoi est-il important d’avoir une quantité suffissante d’ADN matrice?

Answer 17

car si on a pas assez, il n’y aura pas d’amplification. Si on a trop, on va avoir des signaux non-spécifiques

Question 18

c’est quoi les 2 composantes et leur utilité dans le tampon de PCR 10X

Answer 18

1) tris-Cl: sert à tamponner le milieu réactionnel pour optimiser activité de la Taq polymérase
2) MgCl2: pour avoir ions Mg2+ pour faciliter et stabiliser l’hybridation

Question 19

3 options pour choisir la température d’hybridation

Answer 19

Calculer le Tm avec la formule :
Tm=4°Cx(#G+C)+2°Cx(#A+T)
Ou choisir le Tm le plus bas pour des amorces avec différents Tm
Ou par essai erreur en commencant avec 54°C

Question 20

3 critères importants à considérer lors d’un design d’un amorce

Answer 20

1) accessibilité de la région d’amorçage
2) amorçage non-spécifique
3) formation de structures entre les amorces (hairpin, homodimères ou hétérodimères)

Question 21

3 caractéristiques recommendés pour le design d’une paire des amorces

Answer 21

1) 50% GC
2) G ou C en 3’
3) un Tm rapproché pour les 2 amorces

Question 22

Comment visualiser l’ADN après la réaction de PCR

Answer 22

avec l’électrophorèse sur gel

Question 23

comment l’ADN migre sur le gel à électrophorèse

Answer 23

l’ADN est chargé négativement à un pH neutre et donc va migrer vers l’électrode positive quand le gel est submergé dans un tampon qui passe le courant électrique

Question 24

Comment les bandes du gel d’électrophorèse sont visualisés

Answer 24

avec un intercalant d’ADN fluorescent ou de BrEt qui vont marquer les bandes lorsque le gel est illuminé par les rayons UV

Question 25

incovenient du bromure d’éthidium

Answer 25

c’est toxique et mutagène

Question 26

3 applications du PCR

Answer 26

1) caractérisation moléculaire
2) clonage par PCR
3) Quantification moléculaire

Question 27

comment on determine la longeur du fragement amplifié par PCR sur un gel

Answer 27

en le comparant avec l’échelle de PM

Question 28

c’est quoi les minisatelites et leur utilité

Answer 28

régions dans l’ADN qui sont repetées en tandem (différent pour chaque personne). Utilisées pour faire les empreintes d’ADN

Question 29

Pourquoi on utilise le nested PCR

Answer 29

quand on veut détecter des régions d’ADN de faibles concentrations comme l’ADN viral

Question 30

c’est quoi le principe en général pour le nested PCR

Answer 30

on utilise 4 amorces (2 paires=1 paire externe et 1 interne) pour amplifier l’amplicon du PCR normal

Question 31

c’est quoi les étapes pour le nested PCR

Answer 31

1) amplifier une séquence comme du PCR normal avec des amorces externes pour les 10 premiers cycles
2) 2eme amplification avec les amorces internes pour 25 cycles