Chapitre 4.1 Flashcards
c’est quoi la 1ere étape générale pour commencer une application moléculaire pour une protéine recombinante
produire des grandes quantités d’ADNc qui code pour la protéine entière par RT-PCR, clonage par vecteur TA ou autres méthodes
c’est quoi la 2eme étape pour commencer une application moléculaire pour une protéine recombinante
la fabrication de vecteurs plasmidiques qui vont exprimer en grandes qtés la protéine d’interet quand ils sont inserés dans des E.coli compétents
comment s’assure que l’expression d’un gène eucaryote voulu sera possible dans un système (vecteur) bactérien
en ayant un promoteur compatible avec le système/vecteur. Par exemple si le vecteur est bactérien, il faut avoir un promoteur bactérien
c’est quoi l’utilité de l’opéron lac
pour induire l’expression recombinante car c’est une promoteur inductible
Qu’est qu’on a besoin d’ajouter au milieu de culture avec l’opéron lac pour avoir un taux de transcription élevé (en autres mots, comment activer l’opéron lac)
lactose/analogue de lactose (comme IPTG)
4 étapes d’application moléculaire avec opéron lac
1) activer le promoteur avec lactose/IPTG
2) remplacer le gène qui code pour lacZ avec gène d’interet comme G-CSF ADNc
3) transformer E.coli
4) ajouter IPTG et traduction de la protéine recombinante
2 méthodes de transformation
1) utilisation de cellules compétentes
2) électroporation
c’est quoi une méthode de modification pour faciliter la purification de la protéine récombinante
ajouter une courte séquence nucléotidique (étiquette) à l’extrémité de l’ADN insert pour que la protéine exprimée aura 6-7 résidus histidine à l’extrémité C-terminale
Comment purifier les protéines étiquettés (3 étapes)
1)faire une lyse des bactéries qui contiennent les protéines recombinantes
2) fixation des protéines à une matrice d’affinité comme matrice de chélates de nickel pour les étiquettes poly-His
3)libération des protéines liées par diminution de pH de la colonne
quand on fait un étiquettage poly-His dans une protéine, c’est quoi l’ordre des composantes nécéssaires de l’insert
ATG-6xHis-MCS-STOP
c’est quoi une autre méthode d’ajout d’une étiquette autre que l’étiquettage poly-His
ajout d’un épitope. Cela crée une région cible sur la protéine pour un Ac donné
c’est quoi un inconvénient des systèmes d’expression bactériens?
que les protéines ont besoin desubir des modifications post-traductionnels (glycosylation, phosphorylation,…) pour avoir une bonne fonctionnalité
comment assurer la création des modifications post-traductionnelles dans les protéines recombinantes
en faisnt une transfection dans un système eucaryotique
c’est quoi les 2 types de transfections
1) transfection transitoire
2) transfection stable
c’est quoi une transfection transitoire
après que le plasmide pénètre dans la cellule eucaryote, le plasmide s’intègre PAS dans le génome de la cellule. Donc après plusieurs divisions cellulaires, les cellules ne vont pas contenir le plasmide (dépend de vitesse de division)
C’est quoi une transfection stable
quand le plasmide d’integre dans le génome de la cellule et change de manière définitive.
quels enzymes peuvent être responsables de l’integration du plasmide lors d’une transfection stable
enzymes mammifères qui interviennent habituellement dans la réparation de l’ADN et la recombinaison
vu que l’integration du plasmide est rare dans le cas d’une transfection stable, comment assurer l’optimisation de sont intégration. Donne un exemple concret
en ajoutant un marqueur séléctionnable au plasmide pour pouvoir identifier les cellules qui ont un plasmide intégré.
Par exemple, le gène de la néomycine phosphotransférase (Néo r) qui résiste à la néomycine/ substance apparentée (G-418)
est-ce que l’intégration du plasmide dans le génome dans une transfection stable est aléatoire?
oui. Il faudera faire un cribllage des clones car il y a des taux variables d’expression du gène d’interet
2 voies de livraison eucaryotique de plasmide (transfection de cellules)
1) virale
2) non virale
2 types de livraisons virales
1) avec virus à ADN
2) avec virus à ARN
que cible la livraison virale avec virus à ADN
les cellules quiescentes (divisent pas activement, état de dormence, hors du cycle cellulaire)
que utilise la livraison virale avec virus à ARN
les cellules d’empaquetage
comment les cellules d’empaquetage fonctionnent pour la livraison virale de virus à ARN
1)on transfecte la cellule d’empaquetage avec un virus à ARN (vecteur) sans signal d’empaquetage ET un vecteur avec le gène voulu avec un signal d’empaquetage
2) le vecteur ARN est empaqueté dans la cellule et la protéine de particule virale est formée aussi
3) l’ARN empaqueté entre dans la protéine de vecteur viral pour former un vecteur retroviral
c’est quoi les 2 types de livraison non-virale
1) chimique
2) physique
3 types de transfections chimiques et le principe général derièrre cette idée
1) phosphate de calcium (pour cell. adhérentes)
2) cationique
3) liposome
ces 3 méthodes servent à masquer la charge négative de l’ADN pour qu’il puisse être intégré dans la cellule
3 types de transfections physiques
1) microinjection (dans noyau/cytosol)
2) balistique (projectile de complexes ADN/métaux)
3) électroporation
comment les liposomes sont utilisés pour la transfection chimique
l’ADN est attaché aux liposomes et ils entrent dans la cellule en masquant la charge de l’ADN. Ensuite, il y a 3 scénarios:
1) liposome va se dégrader+pas de production de protéines
2) liposome contient de l’ADN et va dans noyau pour transcription et traduction après et forme protéine
3) liposome contient ARN et va directement dans cytosol pour la traduction de la protéine
c’est quoi le liposome stealth?
liposome plus spécifique qui est souvent utilisé avec les animaux/en clinique
que fait l’électroporation
génère des pores dans la membrane des cellules pour recevoir le plasmide
que fait la méthode ballistique
shoot des billes de tungstène qui sont recouverts avec de l’ADN. surtout pour les plantes transgéniques
que fait la microinjection
perce la membrane plasmique de la cellule et injecte le plasmide. Surtout pour cellules germinales
