Chapitre 4.1

Question 1

c’est quoi la 1ere étape générale pour commencer une application moléculaire pour une protéine recombinante

Answer 1

produire des grandes quantités d’ADNc qui code pour la protéine entière par RT-PCR, clonage par vecteur TA ou autres méthodes

Question 2

c’est quoi la 2eme étape pour commencer une application moléculaire pour une protéine recombinante

Answer 2

la fabrication de vecteurs plasmidiques qui vont exprimer en grandes qtés la protéine d’interet quand ils sont inserés dans des E.coli compétents

Question 3

comment s’assure que l’expression d’un gène eucaryote voulu sera possible dans un système (vecteur) bactérien

Answer 3

en ayant un promoteur compatible avec le système/vecteur. Par exemple si le vecteur est bactérien, il faut avoir un promoteur bactérien

Question 4

c’est quoi l’utilité de l’opéron lac

Answer 4

pour induire l’expression recombinante car c’est une promoteur inductible

Question 5

Qu’est qu’on a besoin d’ajouter au milieu de culture avec l’opéron lac pour avoir un taux de transcription élevé (en autres mots, comment activer l’opéron lac)

Answer 5

lactose/analogue de lactose (comme IPTG)

Question 6

4 étapes d’application moléculaire avec opéron lac

Answer 6

1) activer le promoteur avec lactose/IPTG
2) remplacer le gène qui code pour lacZ avec gène d’interet comme G-CSF ADNc
3) transformer E.coli
4) ajouter IPTG et traduction de la protéine recombinante

Question 7

2 méthodes de transformation

Answer 7

1) utilisation de cellules compétentes
2) électroporation

Question 8

c’est quoi une méthode de modification pour faciliter la purification de la protéine récombinante

Answer 8

ajouter une courte séquence nucléotidique (étiquette) à l’extrémité de l’ADN insert pour que la protéine exprimée aura 6-7 résidus histidine à l’extrémité C-terminale

Question 9

Comment purifier les protéines étiquettés (3 étapes)

Answer 9

1)faire une lyse des bactéries qui contiennent les protéines recombinantes
2) fixation des protéines à une matrice d’affinité comme matrice de chélates de nickel pour les étiquettes poly-His
3)libération des protéines liées par diminution de pH de la colonne

Question 10

quand on fait un étiquettage poly-His dans une protéine, c’est quoi l’ordre des composantes nécéssaires de l’insert

Answer 10

ATG-6xHis-MCS-STOP

Question 11

c’est quoi une autre méthode d’ajout d’une étiquette autre que l’étiquettage poly-His

Answer 11

ajout d’un épitope. Cela crée une région cible sur la protéine pour un Ac donné

Question 12

c’est quoi un inconvénient des systèmes d’expression bactériens?

Answer 12

que les protéines ont besoin desubir des modifications post-traductionnels (glycosylation, phosphorylation,…) pour avoir une bonne fonctionnalité

Question 13

comment assurer la création des modifications post-traductionnelles dans les protéines recombinantes

Answer 13

en faisnt une transfection dans un système eucaryotique

Question 14

c’est quoi les 2 types de transfections

Answer 14

1) transfection transitoire
2) transfection stable

Question 15

c’est quoi une transfection transitoire

Answer 15

après que le plasmide pénètre dans la cellule eucaryote, le plasmide s’intègre PAS dans le génome de la cellule. Donc après plusieurs divisions cellulaires, les cellules ne vont pas contenir le plasmide (dépend de vitesse de division)

Question 16

C’est quoi une transfection stable

Answer 16

quand le plasmide d’integre dans le génome de la cellule et change de manière définitive.

Question 17

quels enzymes peuvent être responsables de l’integration du plasmide lors d’une transfection stable

Answer 17

enzymes mammifères qui interviennent habituellement dans la réparation de l’ADN et la recombinaison

Question 18

vu que l’integration du plasmide est rare dans le cas d’une transfection stable, comment assurer l’optimisation de sont intégration. Donne un exemple concret

Answer 18

en ajoutant un marqueur séléctionnable au plasmide pour pouvoir identifier les cellules qui ont un plasmide intégré.
Par exemple, le gène de la néomycine phosphotransférase (Néo r) qui résiste à la néomycine/ substance apparentée (G-418)

Question 19

est-ce que l’intégration du plasmide dans le génome dans une transfection stable est aléatoire?

Answer 19

oui. Il faudera faire un cribllage des clones car il y a des taux variables d’expression du gène d’interet

Question 20

2 voies de livraison eucaryotique de plasmide (transfection de cellules)

Answer 20

1) virale
2) non virale

Question 21

2 types de livraisons virales

Answer 21

1) avec virus à ADN
2) avec virus à ARN

Question 22

que cible la livraison virale avec virus à ADN

Answer 22

les cellules quiescentes (divisent pas activement, état de dormence, hors du cycle cellulaire)

Question 23

que utilise la livraison virale avec virus à ARN

Answer 23

les cellules d’empaquetage

Question 24

comment les cellules d’empaquetage fonctionnent pour la livraison virale de virus à ARN

Answer 24

1)on transfecte la cellule d’empaquetage avec un virus à ARN (vecteur) sans signal d’empaquetage ET un vecteur avec le gène voulu avec un signal d’empaquetage
2) le vecteur ARN est empaqueté dans la cellule et la protéine de particule virale est formée aussi
3) l’ARN empaqueté entre dans la protéine de vecteur viral pour former un vecteur retroviral

Question 25

c’est quoi les 2 types de livraison non-virale

Answer 25

1) chimique
2) physique

Question 26

3 types de transfections chimiques et le principe général derièrre cette idée

Answer 26

1) phosphate de calcium (pour cell. adhérentes)
2) cationique
3) liposome

ces 3 méthodes servent à masquer la charge négative de l’ADN pour qu’il puisse être intégré dans la cellule

Question 27

3 types de transfections physiques

Answer 27

1) microinjection (dans noyau/cytosol)
2) balistique (projectile de complexes ADN/métaux)
3) électroporation

Question 28

comment les liposomes sont utilisés pour la transfection chimique

Answer 28

l’ADN est attaché aux liposomes et ils entrent dans la cellule en masquant la charge de l’ADN. Ensuite, il y a 3 scénarios:
1) liposome va se dégrader+pas de production de protéines
2) liposome contient de l’ADN et va dans noyau pour transcription et traduction après et forme protéine
3) liposome contient ARN et va directement dans cytosol pour la traduction de la protéine

Question 29

c’est quoi le liposome stealth?

Answer 29

liposome plus spécifique qui est souvent utilisé avec les animaux/en clinique

Question 30

que fait l’électroporation

Answer 30

génère des pores dans la membrane des cellules pour recevoir le plasmide

Question 31

que fait la méthode ballistique

Answer 31

shoot des billes de tungstène qui sont recouverts avec de l’ADN. surtout pour les plantes transgéniques

Question 32

que fait la microinjection

Answer 32

perce la membrane plasmique de la cellule et injecte le plasmide. Surtout pour cellules germinales