Chapitre 2.3-banques génétiques Flashcards
c’est quoi les 2 types de banques génétiques
1) banques d’ADN génomique
2) banques d’ADNc
c’est quoi les banques d’ADN génomique en général
le génome au complet qui est digéré en petits fragements pour être étudié
c’est quoi les banques d’ADNc
contient de l’ADNc aux ARNm complets isolés d’une cellule/tissu
c’est quoi le tropisme viral
la queue qui a une spécificité à une cellule hôte spécifique. Si ce n’est pas la cellule hôte spécifique, le bactériophage ne va pas lier sur l’organisme
2 raisons pour lesquelles les phage lambda sont plus efficaces que les vecteurs plasmidiques
1) la transformation des E.coli avec les virions lambda se produit avec un fréquence d’environ 1000 fois plus élevée qu’avec les plasmides
2) on peut pousser et détecter plusieurs clones bactériens infectés avec lambda sur une seule boitre de pétri
c’est quoi un plage de lyse
des trous qui sont formés dans l’agar du pétri après infection de la bactérie avec le phage lambda après leur cycle lytique
c’est quoi la longeur maximale d’un insert pour le phage lambda
25kb
Dans quel endroit l’insert va être inseré dans le phage λ
entre les gènes J et N. La séquence non essentielle du phage va être remplacée avec l’insert
5 étapes d’une construction de banque d’ADN génomique avec un phage λ
1) fragmenter le génome d’interet avec Sau3A par une digestion partielle
2) préparation du phage λ à la reception de l’insert par une digestion avec BamHI
3) ligature par T4 + ATP
4) transformation de l’E.coli
5) analyse/purification de la banque génétique
c’est quoi les 11 étapes d’une construction de banque d’ADNc avec un phage λ
1) extraction complète de l’ARNm d’un type cellulaire/tissu
2) ajouter amorce d’oligot-dT pour commencer la transcription inverse pour generer ADNc
3) digestion de l’ARN restant par digestion alcaline/RNAses
4) ajouter queue poly-G à 3’ à l’aide de TdT
5) ajouter amorce oligo-dC et créer un double brin avec l’ADN polymérase
6) méthyler l’ADNc db aux sites de restriction
7) ajouter courte molécule d’ADN db qui contient des sites de reconnaissance pour une enzyme de restriction aux 2 extrémités de l’ADN à l’Aide de T4
8) clivage par enzyme de restriction pour générer des sticky ends+clivage par même enzyme pour phage λ pour le préparer pour la reception
9) ligation de l’insert et du phage λ avec T4
10)les virions contiennent l’ADN recombinant et sont assemblés in vitro
11) étalement des phages λ sur un tapis bacétrien pour former des plages de lyse
c’est quoi un avantage et un désavantage pour une banque d’ADNc faite avec phage λ
avantage: on peut identifier les clone qui sont fortement exprimés dans la cellule au moment de l’Extraction de l’ARN
désavantage: plus difficile d’identifier les ARNm plus rare car c’est une seule copie (1 brin) et c’est d’habitude les ARNm les plus exprimés qui seront transcrit
quelle est la longueur maximale de l’insert pour un cosmide
35-45kb
différence entre cosmide et phage λ en terme de formation de banque génétique
dans les cosmides, les gènes qui codent pour les protéines virales sont absentes et il n’y a pas de formation de nouvelles particules virale ou de plages de lyse
étapes d’une construction de banque d’ADN génomique avec un cosmide
1) cliver le cosmide au site COS et le génome avec une enzyme de restriction et lier les 2 avec une ligase
2) empaquetage de l’ADN dans la tête du cosmide après reconnaissance du site COS
3) transformation de l’E.coli
4) Sélection par resistance (à l’Ampi par exemple)
Quelle est l’approche générale pour la sélection des clones qui portent un gène/région spécifique
c’est une approche qui utilise des sondes oligonucléotidiques qui se fixent au clone recombinant qui contient la séquence recherchée. c’est un test d’hybridation sur filtre
