chapitre 2.2-ADN recombinant et vectoriel

Question 1

Pourquoi introduire un fragement d’ADN dans une molécule d’ADN vectoriel

Answer 1

pour amplifier la séquence/le fragement d’interet dans une cellule hôte. (clonage)

Question 2

c’est quoi les 2 vecteurs qui sont fréquemment utilisés pour le clonage

Answer 2

plasmides (ADN db circulaire) et bactériophages (virus bactérien à ADN circulaire)

Question 3

c’est quoi le rôle de l’ADN ligase lors du clonage

Answer 3

lier les extrémités d’un fragement de restriction de façon covalente aux fragements de restrictions de l’ADN vectoriel

Question 4

Quel type de liaison l’ADN ligase va créer

Answer 4

laision covalente phosphodiester

Question 5

c’est quoi l’ADN ligase la plus utilisée pour les clonages et pourquoi

Answer 5

bactériophage T4, car elle est capable de liger les blunt ET sticky ends (priorise sticky ends car plus proche)

Question 6

Quelle molécule est absolument nécessaire pour le fonctionnement de la T4

Answer 6

ATP

Question 7

Pourquoi utiliser des sticky ends et non des blunt ends lors du clonage d’ADN pour la ligation

Answer 7

car les sticky ends sont plus spécifiques (besoin de complémentarité) assurent un clonage directionnel d’un fragement d’ADN dans un vecteur, tandis que les blunt ends sont moins spécifiques et peuvent s’associer dans les 2 directions

Question 8

Si l’ADN est linéaire et il y a n coupures, combien de fragements de restriction seront générés

Answer 8

n+1

Question 9

Si l’ADN est circulaire er il y a n coupures, combient de fragements de restriction seront générés

Answer 9

n

Question 10

c’est quoi les 2 types de plasmides qu’on peut avoir

Answer 10

vecteurs de clonage (classiques ou TA) et vecteurs d’expression (ajout d’épitope ou d’un fluorophore)

Question 11

c’est quoi le troisième type de vecteurs autre que les plasmides et les bactériophages

Answer 11

cosmides

Question 12

c’est quoi les 3 régions essentielles pour le clonage de l’ADN dans un plasmide

Answer 12

1) origine de replication
2) marqueur permettant la sélection (resistance à l’ampi par exemple)
3) polylinker/SCM (région spécialisée pour recevoir un insert d’ADN d’interet)

Question 13

c’est quoi l’origine de réplication (ORI)

Answer 13

enzymes de la cellule hôte identifient la séquence de 50-100pb au niveau de l’origine de réplication pour ensuite continuer à la séquence qui a été inserée après l’ORI

Question 14

c’est quoi un marqueur de sélection

Answer 14

gène qui est responsable pour un résistance quelconque (ex: amp r, kan r, zeo r) afin de pouvoir sélectionner positivement les cellules qui expriment le plasmide

Question 15

c’est quoi un site de clonage multiple

Answer 15

séquence polylinker synthétique qui contient des séquences de reconnaissance de plusieurs enzymes de restriction pour augmenter l’adaptabilité d’un vecteur plasmidique

Question 16

Comment fonctionne une application expérimentale pour la sélection bleu/blanc des clones

Answer 16

on insert un gène de LacZ avec mutation qui ne code plus pour la beta-galactosidase. On introduit Xgal (substrat pour beta-galactosidase qui donne produit bleu insoluble) et le IPTG (qui lie sur represseur lacI et induit la transcription). Les clones avec les plasmides vont être blancs car le beta-gal est inactivé et ils ne peuvent pas cliver Xgal

Question 17

c’est quoi une bactérie compétente

Answer 17

bactérie ayant recu un traitement pour la permeabiliser pour la reception du plasmide/nouveau matériel génétique

Question 18

c’est quoi le processus de transformation

Answer 18

quand les cellules compétentes recoivent le plasmide et son génome est modifié de façon définitive

Question 19

c’est quoi les vecteurs TA

Answer 19

vecteur utilisé pour augmenter la complémentarité entree les extrémités du vecteur et de l’insert par PCR. Le TA contient un U ou un T sur les overhang 3’. L’insert va avoir un A sur son overhang 3’ pour avoir une complémentarité facile

Question 20

c’est quoi un vecteur d’expression avec étiquetage

Answer 20

c’est quand on ajoute un épitope sur l’ADN recombinant. C’est utilisé pour avoir une région cible sur la protéine recombinante par un Ac donné

Question 21

c’est quoi les cosmides

Answer 21

c’est des hybrides de plasmides et d’ADN phagique lambda

Question 22

c’est quoi l’utilité des d’utiliser les cosmides comme vecteur

Answer 22

ils sont capable de recevoir des fragements de 35-45kb (beaucoup plus que les plasmides). C’est utilisé pour l’études des gènes et augmente les chances d’une isolement d’un gène au complet car sa longeur est entre 30-40kb pour les eucaryotes