Chapitre 3.2-séquençage et clonage par PCR

Question 1

c’est quoi le séquençage

Answer 1

détermination de la succession des nucléotides dans une séquence d’ADN

Question 2

c’est quoi les 3 types de séquençages

Answer 2

1) Séquençage manuel (sanger)
2) séquencage automatique
3) séquencage de nouvelle génération

Question 3

c’est quoi les ddNTP

Answer 3

des dNTP sans groupement hydroxyle 3’, donc la synthèse de la chaine arrete après l’ajout du ddNTP

Question 4

c’est quoi les 4 types de ddNTP

Answer 4

ddATP (adénine), ddCTP (cytosine), ddTTP (thymine) et ddGTP (guanine)

Question 5

Comment faire le sequencage de type Sanger

Answer 5

on effectue 4 réactions distinctes qui a chacune un type de ddNTP à faible concentration par rapport aux dNTPs.
les ddNTP sont marqués

Question 6

comment visualiser les résultats du séquencage sanger?

Answer 6

on place les 4 réactions du séquencage sur gel et one détermine la séquence en regardant la taille de différents fragments

Question 7

comment lire le gel qui contient les contenus des 4 réactions de sequencage de Sanger?

Answer 7

on lit les bandes en commencant par les plus migrés (bottom to top) et chaque colonne represente un différent nucléotide

Question 8

c’est quoi le séquencage automatique et comment on le fait?

Answer 8

même principe que sanger. on marque les fragments d’ADN avec 4 colorants fluorescents différents et le séquenceur va mettre ces 4 réactions sur gel à électrophorèse. l’appareil lit l’ordre d’apparition des 4 colorants et le présente sous forme de courbe avec 4 différentes couleurs

Question 9

c’est quoi le séquencage de nouvelle génération

Answer 9

c’est du séquençage à haut débit qui est combiné avec la bioinformatique. Elle peut séquencer un ensemble de fragements d’interet simultanement.

Question 10

5 étapes de l’isolement d’un segment spécifique d’ADN génomique par PCR pour le clonage

Answer 10

1) on ajoute des amorces qui contiennent des sites de restriction. Il faut s’assurer que ces sites sont uniques au nouveau amplicon
2) on amplifie par PCR et fair synthèse d’ADN
3) on clive avec les enzymes de restriction
4) ligation de l’ADN avec le plasmide
5) transformation de l’E.coli

Question 11

c’est quoi le PCR inverse ou RT-PCR

Answer 11

technique de PCR pour isoler un ARNm spécifique

Question 12

2 utilisations de la RT-PCR

Answer 12

1) construction de banque ADNc
2) expression différentielle (comparer expressions des gènes à diff. conditions)

Question 13

c’est quoi les 2 difficultés par rapport à la méthode de RT-PCR

Answer 13

que la contamination par l’ADN génomique est facile ou contamination des ARNases qui dégrade l’ARN

Question 14

3 étapes pour l’isolement de l’ARNm par PCR

Answer 14

1) extraction de l’ARN total et transcription inverse par les transcriptases inverses pour former l’ADNc-il faut ajouter amorce polyT et dNTP
2)inhibition de la transcriptase inverse et l’ARN par traitement d’ARNase
3) polymérase catalyse la synthèse du 2eme brin complementaire à l’ADNc

Question 15

d’où viennent les transcriptases inverses

Answer 15

rétrovirus

Question 16

3 stratégies pour éliminer la contamination de l’ADN génomique qui va competitionner avec l’ADNc

Answer 16

1) traiter l’ARNm avec le désoxyribonucléase pour éliminer l’ADN génomique
2) utiliser des amorces dans 2 différents exons adjacents d’un intron
3) purification par chromatographie de l’ARN cellulaire total sur une colonne avec des oligo-dT pour capter l’ARNm