Chapitre 2.1-enzymes de restriction Flashcards
c’est quoi l’ADN recombinant
toute molécule d’ADN qui contient des séquences qui proviennent de différentes origines
c’est quoi une protéine recombinante ou l’ARN recombinant
protéine ou ARN derivée de l’ADN recombinant
c’est quoi un vecteur d’ADN
une molécule composée d’acide nucléique (habituellement circulaire) qui est capable de se repliquer dans une cellule hôte
c’est quoi un insert
une molécule d’ADN recombinant qui est inserée dans le vecteur
la fréquence de duplication d’ADN recombinant dépende de 3 choses. Nomme-les
1) type de cellule hôte
2) niveau d’activité de la cellule hôte
3) type du promoteur sur le vecteur d’ADN
c’est quoi les 6 étapes du clonage d’ADN
1) construction du vecteur+insert
2)transformation de bactérie competente (réplication et production d’ADN)
3) purification et séquencage de l’insert
4) insertion de l’ADN dans le modèle cellulaire à l’étude
5) expression de la protéine recombinante
6)analyse biochimique et cellulaire
la manipulation génétique des molécules d’ADN est possible grâce à ces 2 enzymes recombinantes purifiées:
enzymes de restriction et les ADN ligases
c’est quoi un enzyme de restriction
endonucléases produites par les bactéries qui reconnaisent des séquences spécifiques de 4-18pb (sites de restrictions)
quel lien les enzymes de restriction sont capables de cliver et quel est le resultat de ce clivage
elles clivent un lien phosphodiester et generent un 3’hydroxyle et 5’phosphate
c’est quoi une enzyme de modification
une enzyme produite par les bactéries qui sert à ajouter un groupement methyl à 1-2 bases dans les sites de restrictions pour proteger l’ADN bactérien contre les enzymes de restriction en détruisant l’ADN étranger entrant par un virus/autre bactérie
c’est quoi les 4 types d’enzymes de restriction
type I, II, III, et IV
caractéristiques des enzymes de restriction de type I et III
reconnaisent séquence d’ADN spécifique et coupe à un endroit aléatoire éloigné du site reconnu
caractéristiques des enzymes de restriction de type II
il y a 3 sous catégories (2, 2a, 2b) et elles sont les plus utilisées. Elles reconnaissent une séquence spécifique et coupent à un endroit spécifique
Caractéristiques pour chacune des sous catégories pour les enzymes de restriction de type II
2-reconnais et coupe un site palindromique spécifique
2a-reconnais séquence non palindromique et coupe à l’extérieur du site de reconnaissance
2b-coupe à chaque extremité (3’ et 5’) du site de restriction
Caractéristiques pour les enzymes de restriction de type IV
ciblent seulement les ADN methylés
c’est quoi un overhang
une extrémité simple brin débordante après la génération des sticky end (bouts collants). Peut se faire en 3’ ou 5’
c’est quoi la spécificité d’appariement pour les sticky ends
peuvent seulement s’associer avec d’autres sticky ends coupés par la même enzyme. Appariement très spécifique
c’est quoi les blunt ends
des coupures au même endroit sur les 2 brins d’ADN qui generent aucun overhang
c’est quoi la spécificité des appariements pour les blunt ends
ils peuvent s’associer avec n’importe quelle autre séquence de blunt ends (même si c’était coupé par un autre enzyme )
c’est quoi les fragements de restriction
fragements generés après le clivage reproductible par les enzymes de restriction
c’est quoi une carte de restrictions
une carte qui donne l’ordre et la fréquence des sites de restriction et la taille des fragements produits
Comment créer une carte de restriction avec 2 enzymes différentes
on fait une digestion simple par chacune des enzymes et on voit les fragements générés. Ensuite, on effectue une double digestion poour voir l’ordre du clivage par ces 2 enzymes
le nombre de coupures par les enzymes de restriction dépendent de 2 choses:
le nombre de nucléotides dans le site de restriction et le % en G et C
comment calculer la taille moyenne des fragements générés par une enzyme de restriction
on multiplie les probabilities d’avoir le nucléotide voulu pour chaque base dans la séquence de restriction. si c’est 25% d’avoir G/A/T/C on utilise la formule (1/4)^n ou n=nombre de nucléotides dans le site de restriction
