Chapitre 3.3-PCR quantitatif

Question 1

3 types de PCR quantitative

Answer 1

sur gel, PCR en temps réel, PCR multiplex

Question 2

3 exemples pour le PCR en temps réel

Answer 2

SYBR green, Taqman, balise moléculaire

Question 3

2 exemples de PCR multiplex

Answer 3

quantification absolue et quantification relative

Question 4

c’est quoi le PCR en temps réel

Answer 4

une technique qui permet de faire une réaction PCR regulière, mais qui utilise un marqueur fluorescent qui permet de suivre la réaction et quantification de l’amplicon en temps réel

Question 5

avantage du PCR en temps réel vs PCR classique

Answer 5

PCR en temps réel permet de quantifier la quantité initiale de l’ADN cible

Question 6

2 utilités du PCR en temps réel

Answer 6

1)quantification relative des gènes d’interet par rapport aux gènes de référence non régulés (non-inductibles)
2)Quantification absolue par rapport (# de copies) par rapport à un standard externe

Question 7

c’est quoi les limites du PCR en temps réel par rapport à la courbe pour les résultats (comment interpreter la courbe)

Answer 7

-le premier plateau represente le bruit de fond car la fluorescence du background est plus grande que celle de l’amplicon
-la phase exponentielle suit la fluorescence de l’amplicon
-le deuxième plateau represente le manque de réactifs qui mène à la fin de la réaction et fluorescence

Question 8

Quelle type de substance est utilisée pour la fluorescence du PCR en temps réel? donne 1 exemple

Answer 8

un intercalant d’ADN fluorescent comme le SYBR green qui s’insère entre l’ADN double brin seulement!

Question 9

c’est quoi le seuil de cycle/cycle threshold/Ct

Answer 9

c’est le nombre de cycle requis pour avoir un niveau de fluorescence (entre 15 et 30 usually)

Question 10

comment interpreter un Ct élévé vs un Ct bas

Answer 10

pour un Ct élévé- on voit que ça prend plus de cycles pour atteindre un niveau de fluorescence, donc le matériel d’ADN de départ est à une faible []

Pour un Ct bas- on voit que la fluorescence commence aux premiers cycles donc l’ADN de matrice est de forte []

Question 11

c’est quoi l’équivalent en terme de quantité d’ADN pour une différence d’un Ct (ex: Ct de 18 vs 19)

Answer 11

une différence d’un Ct veut dire 2 fois plus ou moins d’ADN

Question 12

c’est quoi le PCR à temps réel avec Taqman?

Answer 12

c’est comme du PCR à temps réel avec SYBR green, mais ça utilise des sondes spécifiques pour la région d’interet en plus des 2 amorces spécifiques

Question 13

Comment la sonde de Taqman fonctionne en terme de fluorescence

Answer 13

elle a 2 extremités, R (rapporteur fluorescent) et Q (extincteur). Quand R et Q sont à proximité, la fluorescence est inhibée par Q

Question 14

Comment avoir la fluorescence activé avec les sondes de Taqman

Answer 14

la sonde lie à la section d’interet et Taq polymérase dégrade la sonde en synthétisant le 2e brin d’ADN (R et Q sont plus à proximité, donc fluorescence activée et captée en temps réel)

Question 15

Avantages et inconvénients de Taqman

Answer 15

1) très spécifique
2)plus cher
3) plus d’optimisation et design

Question 16

Avantages et inconvénients pour SYBR green

Answer 16

1) moins cher
2) moins spécifique (lie à n’importe quel ADNdb)

Question 17

c’est quoi la méthode de la balise moléculaire en PCR (molecular beacon)

Answer 17

même principe que le Taqman mais la sonde qui est utilisée est en forme d’épingle à cheveux. Par besoin de dégrader la sonde, seulement l’ouvrir pour éloigner R et Q

Question 18

c’est quoi le PCR multiplex

Answer 18

PCR qui amplifie plus qu’un amplicon à la fois. Utilise plus qu’une paire d’amorces. Peut se faire en point final ou en temps réel

Question 19

utilité du PCR multiplex

Answer 19

comparer un amplicon d’un transcrit non inductible avec un amplicon d’un transcrit d’interet inconnu (gène d’interet vs gène de référence)

Question 20

Comment faire la détection de mutations (SNP) par PCR

Answer 20

à l’aide des sondes Taqman (une sonde pour la séquence de l’allèle sauvage et une sonde pour séquence mutée). Fluorophore différent pour chaque sonde

Question 21

Quel est l’aspect le plus cherché dans la détection de mutations par PCR

Answer 21

de vérifier présence/dominance d’une sonde entre les 2 pour confirmer mutation. Pas besoin de quantification