Canal sodique épithélial ENaC dans les alvéoles pulmonaires Flashcards
2 méthodes pour étudier les canaux de transport ionique :
Exp – Etude des transports ioniques ; Culture de cellules alvéolaires de type II : - Digestion des poumons à l’elastase (intra-alvéolaire) 🡪 libère le pneumocyte. - Lavage pour éliminer les cellules sanguines - Broyage, filtrations séquentielles, adhérence différentielle - Permet d’obtenir des cultures pures de pneumocytes de type II et d’étudier les transports ioniques sur membrane semi-perméable en interface liquide-liquide, puis air-liquide
Exp - Canaux cellulaires également étudiables sur des tranches de section (lung-slices) de 300 μm. Permet d’avoir également les pneumocytes de type I, plus difficiles à isoler. (Technique : nécessité au préalable de rendre le poumon solide par de l’agarose (soluble à 37°C, durcit en refroidissant) avant de pouvoir le couper au microtome ; puis, réchauffement pour enlever l’agarose => possibilité d’étudier l’architecture tissulaire et les cellules.)
Exemples de canaux ioniques ?
- NaK-ATPase baso-latérale
- Canaux CFTR
- CNG (dans les Pn I) : Cyclic Nucleotide-Gated cationic channel
-
HSC Highly Selective Cationic channel (ENaC) :
o Activité ENaC typique
o Laissent beaucoup plus entrer Na qu’autres cations
o Bloqués par faible quantité d’amiloride
o Expression des 3 sous-unités -
NSC Non Selective Cationic channel :
o ENaC-like
o Laissent autant entrer Na que K
o Bloqué par forte quantité d’amiloride
o Nécessite de l’expression de α-ENaC
NSC et HSC sont deux formes différentes du canal ENaC
ENaC :
Est-il voltage ou ligan dépendant ?
Structure ? (cb de su ?)
Etude via clonage (expression ++ dans colon de rat privé de sel) :
- Exprimé sur les épithéliums transportant du Na+ : colon distal, néphron distal, voies aériennes, alvéoles, glandes sudoripares …
- Canal épithélial (seul canal sodique dans les cellules épithéliales)
- Non voltage- ni ligand-dépendant
Structure :
- Constitué de 3 sous-unités homologues : α, β, γ, parfois δ (chez homme, pas chez le rat) codées par les gènes SCnn1a, Scnn1b, Scnn1c
- Extrémité N-term et C-term sont intracellulaires
- Premier domaine transmembranaire
- Large boucle extra-cellulaire (80% des acides aminés)
- Deuxième domaine transmembranaire
- Domaine PY (répétition de proline) au niveau de l’extrémité C-term de chaque sous-unité du récepteur. Rôle fonctionnel important dans la régulation de l’expression de ENaC à la membrane
Etude en Patch-clamp :
Conductance faible ou forte ? sléectivité ionique ? sensibilité amiloride ?
De quoi est fonction la conductance de ENaC ? (2)
- Conductance : faible conductance unitaire (4-6 pS)
- Sélectivité ionique : Li2+ > Na+ >> K+
- Caract. pharmacol. : forte sensibilité à l’amiloride à des faibles concentrations (Ki < 50nM)
Conductance :
- Nombre de canaux exprimés à la membrane : N0 (« trafficking » des canaux à la membrane : adressage et insertion des canaux à la membrane apicale, endocytose des canaux exprimés à la membrane) 🡪 Plus il y en a, plus il y a de Na réabsorbé
- Probabilité d’ouverture unitaire : P0 : dépend du clivage protéolytique des sous-unités. Quand P0 = 1 : tous les canaux sont ouverts. => Donc : I = N x P0
ENaC est-il majoritairement intraCaire ou membranaire ?0
PII : HSC > NSC oui ou non ?
- Le canal est présent mais situé en majorité en intracellulaire, très peu en membranaire.
- Dans les Pn II, expression HSC > NSC.
Quelles différences entre HSC et NSC ?
HSC:
- condutance 4-7/pS
- PNa/PK : 80, très sélectif Na
- Bloqués par faible concentration Amiloride
- Nécessitent expression des 3 su
NSC :
- conductance 21S
- PNa/PK = 1
- Bloqués par fortes doses d’amiloride
- Nécessitent l’expression alpha ENaC
Que se passe-t-il si KO alphaENaC ?
Que se passe-t-il si KO beta ou gamma ENaC ?
- Souris αENaC-/- : non viables, décèdent de détresse respiratoire néonatale en 40h par défaut de résorption du liquide intra-alvéolaire ; rapport poids du poumon humide/sec élevé en faveur d’un oedème pulmonaire par défaut de résorption
⇨ La sous-unité α-ENaC est indispensable au fonctionnement de ENaC
- Souris β ou γ ENaC -/- : simple retard de résorption du fluide alvéolaire, décès par dysfonctionnement rénal
Parmis les transports de Na, lequel est limitant ?
De quoi dépend la fonction d’ENaC ? (2)
- L’activité d’ENac est très finement régulée dans tous les organes ou elle est exprimé. C’est l’étape limitante du transport de Na+ (par rapport à la NaK-ATPase, qui est présente abondamment dans la cellule)
Régulation de ENaC fonction de N*P0.
- N : dépend du trafficking des canaux à la membrane (équilibre adressage-insertion et endocytose)
- Po : dépend des clivages protéolytiques des sous-unités
C’est l’un des rares canaux dont la fonction est dépendante du clivage protéolytique.
Eléments stimulant ENac et diminuant ENaC ?
Stimulation ENaC:
- Catécholamines et agonistes β-adrénergiques
- Glucocorticoïdes (effet transcriptionnel et post-transcriptionnel)
- Protéases, notamment channel Activating Proteases (CAP)
- Keratinocyte Growth Factor (KGF)
- TGF, EGF, TNFa
Diminution ENaC :
- Dérivés réactifs de l’O2 et du NO
- Anesthésiques halogénés
- Hypoxie
- ANF
- TGF-β
Etapes de production d’ENaC ?
Durée de vie sur la membrane ? durée de vie totale ?
- Les 3 sous-unités s’assemblent précocement en trimère dans le RE.
- Passage dans le Golgi, via mécanismes impliquant glycosylations, clivage des sous unités. Séquence impliquant la sérine protéase Furin
- Stockage en pool intracellulaire en attendant l’adressage
- Adressage : Exocytose (stimulée par l’AMPc) et activation.
- Puis endocytose d’ENaC. Le processus d’endocytose nécessite l’ubiquitination, sous la dépendance de protéines ubiquitaires, notamment Need4-2 (ubiquitin protein ligase E3) qui ubiquitine ENaC via le domaine PY de la chaine C-terminale de β-eNac.
- Il est ensuite soit recyclé (petite partie), soit dégradé dans le protéasome (majorité des canaux).
- Durée de vie sur la membrane : 12-17 min.
- Durée de vie totale d’ENaC : 40-70 min.
Comment agissent les agents augmentant l’activité d’ENaC ?
Exemples CTC ?
- Soit par hyperadressage
- Soit par inhibition de la dégradation proteasique de ENaC (inihibition de la protéine kinase A)
- Soit par inhibition de l’endocytose
Corticoïdes :
Les glucocorticoïdes et minéralocorticoïdes (poumon / rein) :
- Stimulent la transcription de gènes codant pour les différentes sous unités de ENaC
- Activent SGK (serum glucocorticoid-induced kinase), bloquent l’endocytose d’ENaC par phosphorylation de la protéine ubiquitaire Nedd4-2, qui ne peut donc plus se lier sur le domaine PY des sous-unités de ENaC
- Dans le rein, aldostérone permet réabsorption Na en bloquant Nedd4-2.
Qu’est ce que le sd de Liddle ?
Syndrome de Liddle : anomalie de b ENaC responsable d’un sd d’hypertension artérielle familiale.
Exon 13 codant sur le domaine PY de l’extrémité C-Term, permettant liaison Nedd4-2 et ubiquitination. Altération de la séquence d’AA au niveau de PY ou délétion de la séquence PY entraine un défaut de fixation de Need4-2 sur ENaC
🡺 Défaut d’ubiquitination
🡺 Altération de l’endocytose
🡺 Hyper expression membranaire de ENaC
🡺 augmentation de la réabsorption hydrosodée au niveau rénal
🡺 HTA
Effet de la mutation du sd de Liddle dans le poumon ?
Effet de cette mutation au niveau pulmonaire ? Evaluation de la clairance du fluide alvéolaire, sans et avec amiloride (inhibiteur de ENac)
⇨ Au niveau pulmonaire, eNaC est l’étape limitante du transport de Na+. Une activation de ENaC est associée à une augmentation de la clairance alvéolaire avec un effet dose.
⇨ Le syndrome de Liddle protège en partie contre les oedèmes hydrostatiques (existence d’un oedème interstitiel, mais pas alvéolaire), mais pas contre le SDRA néanmoins.
Effet de l’hypoxie sur ENac, modèle de chambre de Ussing ?
Effet B2 agoniste sur ENaC ?
Effets hypoxie :
- Diminution sous hypoxie de la conductance amiloride-sensible (AS) du canal eNaC
- Stabilité de la conductance amiloride-résistant (AR) - Baisse du courant de court-circuit AS très rapide (non via régulation transcriptionnelle !)
- La quantité de ENaC total est conservée mais diminution de l’expression membranaire des 3 sous unités d’ENaC (++ bêta et gamma) en hypoxie.
- Augmentation de l’ubiquitinisation de α-ENaC en hypoxie => implique Need4-2
Effet des β-agonistes in vivo et in vitro
- Augmente l’adressage de ENaC à la membrane (in vitro)
- Reverse l’effet de l’hypoxie : empêche diminution du courant AS (in vivo)
En synthèse : En hypoxie, baisse de la quantité d’ENaC membranaire par augmentation de son ubiquitination (donc sequestré dans le protéasome) 🡪 diminution de la clairance alvéolaire
L’adjonction de b agoniste in vitro augmente l’adressage d’ENaC à la membrane.
