aspects expérimentaux Flashcards
Pourquoi la mesure de l’absorbance est une méthode de choix?
- Fréquemment disponible
-Peu couteuse
-Peut être utilisée pour une grande variété de réactions - Substrats générant des produits colorés disponibles commercialement pour plusieurs enzymes
- Se prête bien aux essais en continu
- se prête à la détection indirecte
Quels sont les défauts de la mesure d’absorbance?
- Méthode peu sensible
- La portée de la réponse linéaire peut être limitée
- Ne s’applique pas aux solutions troubles
Que faut-il connaître pour transformer les données d’absorbance en données de concentration?
Le coefficient d’extinction molaire
Quels sont les avantages de la mesure de fluorescence?
- Appareil assez fréquemment disponible
- Peu couteuse
- Peut être utilisée pour de grande variété de réaction
- Substrat générant des produits fluorescent disponibles commercialement pour plusieurs enzymes
- Se prête bien aux essais en continu
- Plus sensible que l’absorbqnce
- La portée de la réponse linéaire est élevée
- Se prête à la détection indirecte
Quels sont les défauts de la mesure de fluorescence?
- Spectrofluorimètre peu répandus
- Il faut établir une courbe standard pour convertir les données de fluorescence en donnée de concentration
Quels sont les avantages de la mesure par séparation?
-Permettent d’identifier les produits réactionnels
- Permettent des analyses par une variété de méthodes qui exploitent les diverses propriétés biophysiques de molécules
Quels sont les défauts de la mesure par séparation?
- Ne se prête généralement pas aux essais en continu
- demande plus de temps pour analyser les échantillons
Quels sont les types d’analyses possibles pour les techniques de séparation?
- Électrophorèse
- HPLC
- Extraction par solvant organique
- Filtration
- Électrophorèse capillaire
- TLC
- LC-MS
Nomme un avantage et un désavantage de la calorimétrie
A:
- Permet de mesurer deltaH et deltaS donc de calculer deltaG
D:
- Technologie pas toujours disponible
Quels sont les avantages de la technologie de resonance plasmonique de surface (SPR)
- Mesure les constantes de vitesse d’association et de dissociation d’un ligand. Kd peut être calculée
- Détecte la liaison d’un ligand à un récepteur
- Ne nécessite aucun marquage ce qui le rend très versatile et permet d’étudier tout comlpexe RL
Quel est le désavantage de la technologie SPR?
appareil spécialisé et couteux pas toujours disponible
Quels sont les trois grandes catégories d’essais enzymatiques?
- essai direct
- essai indirect
- essai enzymatique couplé
Décrire les 3 grandes catégories d’essais enzymatiques
Direct:
Molécule est détectée directement sans l’ajout d’autre composé
Indirect
nécessite l’ajout d’un composé qui permettra de détecter et quantifier soit le produit ou le substrat
Couplé
nécessite l’ajout d’une seconde enzyme qui utilisera le produit d’une première réaction enzymatique comme substrat pour générer un produit qui pourra être quantifié
Quelle est la différence entre un essai continu et discontinu?
continu: essai ou la progression d’une réaction est suivie par la mesure d’un signal en temps réel
Discontinu: collecte et analyse d’un nombre restreint d’échantillon pour la quantification du produit synthétiser ou du substrat restant
Lors d’un essai enzymatique couplé, pourquoi la 2ieme enzyme doit catalyser une réaction rapide?
afin qu’elle n’affecte pas les cinétiques globales qui correspondent à celle de la première réaction
Vrai ou faux
Un essai discontinu est habituellement priorisé par rapport à un essai discontinu
Faux, contraire
Donne un avantage de l’essai en continu
Il est facile de vérifier que la vitesse de la réaction progresse de façon linéaire
Pourquoi il y a un risque de sous-estimé la Vi avec un essai discontinu?
Parce que le nombre de points est limité. S’il est limité à un seul point, il n’est pas possible de vérifier si des vitesses initiales ont bel et bien été mesurées.
Les essais en continu utilisent habituellement quelles méthodes?
méthode spectroscopique comme absorbance ou fluorescence
Les essais discontinu utilisent généralement quelles méthodes?
Essais souvent effectués avec un nombre limité d’échantillon comme méthode de séparation
Vrai ou faux
Le choix de la gamme de [S] doit être restreint par rapport à la Km
Faux, large gamme de [S] par rapport à la Km
idéalement 0.5 à 10Km
Qu’arrive-t-il si l’expérience à trop peu de mesures à haute [S]?
permet pas de bien estimer Vmax et donc Km
Qu’arrive-t-il s’il y a trop peu de mesures à basses [S]?
permet pas bien d’estimer Vmax/Km et donc Km
Dans quelle situation il peut être correct de prendre une gamme de [S] plus restreinte?
Quand on sait déja que l’enzyme suit le modèle de Henri-Michaelis-Menten
Comment peut-on valider la stabilité d’une enzyme pour un mécanisme simple?
Mesure de V0 à plusieurs [E] doit montrer une relation linéaire
Quelle information avons-nous si la mesure de V0 ne montre pas une relation linéaire à plusieurs [E]?
L’enzyme est peut-être instable et s’inactive dans le temps
Que faut-il vérifier si la V0 décroit à plus haute [E]?
- Que le système de détection répond de façon linéaire
- Que les conditions de mesure de Vi sont respectées
Que faut-il vérifer si V0 croit à plus haute [E]?
La présence d’un inhibiteur dans le milieu réactionnel ou d’un activateur dans la préparation d’enzyme
Quel test permet de détecter l’inactivation d’un enzyme dans le temps?
Test de selwyn
En quoi consiste le test de Selwyn?
Ce test consiste à mesurer des courbesde progression de réaction enzymatique à différentes 𝐸 . On porte ensuite engraphique la quantité de produit synthétisé (sur l’axe y) en fonction du produit de𝑬et du temps que l’on porte sur l’axe x (Graphiques de gauche). Comme la quantité deproduit formé dépend de la quantité d’enzyme présente, il découle que la quantité deproduit est fonction du produit de la concentration d’enzyme et du temps ( 𝐸 𝑡=f 𝑃 ). Par exemple, s’il y 2x plus d’enzyme, la même quantité de produit est synthétiséen 2x moins de temps. Si l’enzyme est stable, des courbes de la 𝑃 en fonction de𝐸 𝑡devraient se superposer (Graphique de gauche, en haut). Si l’enzyme est instable, lescourbes ne se superposeront pas
