A5 TÉCNICAS DE PATOLOGÍA MOLECULAR Flashcards
1
Q
Proceso de DNA a RNA
A
Transcripción
2
Q
Proceso RNA a proteína
A
Translation - traducción
3
Q
Porcentaje DNA transcrito y porcentaje DNA que codifica para proteínas
A
70%
Sólo el 2%
4
Q
Clases de ncRNA
A
miRNA
circularRNA
IncRNA
5
Q
Primeros miRNA descritos
A
Lin-4: primero descrito, función en nematodos
Let-7: segundo descrito: papel en regulación del desarrollo tardío y diferenciación celular. Conservado en diversos organismos, incluidos los humanos. Implicación en cáncer. Supresor de tumores en humanos.
6
Q
Función general miRNA
A
Los miARNs son pequeños ARN no codificantes (aproximadamente 22 nucleótidos de longitud) que regulan la expresión génica post-transcripcionalmente. Lo hacen uniéndose a regiones específicas del ARN mensajero (ARNm) y promoviendo su degradación o bloqueando su traducción a proteínas.
7
Q
miR-155 over-expression is prognostic in…
A
lung cancer
“patients with…high hsa-mir-155…had poorer survival than the patients with low hsa-miR-155.”
8
Q
MicroRNAs can be oncogenes or tumor suppressors?
A
MicroRNAs can be oncogenes and tumor suppressors
9
Q
Technologies for detecting miRNAs
A
- Northern blot
- In situ hybridization
- qRT-PCR
- Microarray/hybridization
- Low density qRT-PCR arrays
- miRNA-seq
10
Q
El flujo básico de un experimento de proteómica consiste en:
A
o Obtención de la muestra biológica.
o Extracción de las proteínas.
o Digestión enzimática de las proteínas en péptidos.
o Separación de los péptidos por HPLC (cromatografía líquida).
o Espectrometría de masas, para detectar la masa de cada péptido, lo que permite
identificar la secuencia del péptido.
o Análisis de los datos.
11
Q
El proteoma es la totalidad de proteínas expresadas en una célula, que varía
dinámicamente en función de cuatro niveles regulatorios:
A
abundancia de proteínas,
modificaciones post-traduccionales, interacciones entre proteínas y localización subcelular.
12
Q
Para la preparación de la muestra para estudio proteómico, ¿qué enzima se utiliza para la digestión enzimática?
A
Tripsina
13
Q
¿Qué es la cromatografía líquida?
A
El proceso cromatográfico separa péptidos en una columna con matriz y solvente según su afinidad por la fase móvil o estacionaria. Sin embargo, la alta abundancia de ciertas proteínas, como la albúmina en plasma (más del 50%), puede dificultar el análisis. Para resolverlo, se usa electroforesis para identificar y eliminar proteínas abundantes, dejando el resto para el experimento. Esto evita interferencias y mejora la detección de péptidos menos representados en la muestra.
14
Q
que es un espectrómetro de masas en proteómica
A
Un espectrómetro de masas en proteómica identifica y caracteriza proteínas analizando iones según su relación masa/carga (m/z). Sus componentes principales incluyen:
- Fuente de ionización (ESI o MALDI): Convierte proteínas o péptidos en iones.
- Sistema de vacío: Garantiza un ambiente sin colisiones indeseadas.
- Analizador de masas (TOF, Orbitrap, cuadrupolo): Separa iones según su m/z.
- Célula de colisión: Fragmenta iones seleccionados para análisis estructural.
- Detector: Registra los iones y genera datos.
- Software: Procesa datos y compara espectros con bases de datos.
Es esencial para identificar proteínas, estudiar secuencias y cuantificar niveles en estudios biológicos.
15
Q
Determinación del punto de corte para un marcador: deben tenerse en cuenta los criterios de
A
sensibilidad, especificidad y área bajo la curva.
16
Q
Censura por la derecha
A
el evento no ha sucedido en el tiempo de estudio (ejemplo, aparición de metástasis en los dos años posteriores al tratamiento). No significa que no vaya a suceder el evento, pero no ha sucedido durante el tiempo de estudio.
17
Q
censura independiente
A
(por la finalización del estudio o la pérdida del
seguimiento)
18
Q
censura dependiente
A
(pérdida de seguimiento relacionada con el suceso, como por ejemplo la progresión de la enfermedad, el abandono del tratamiento por los efectos secundarios o los riesgos competitivos).
19
Q
Curvas de Kaplan-Meier:
A
estimación no paramétrica de la supervivencia de los individuos de un estudio.
Sería el equivalente a la frecuencia observada de individuos vivos en cada momento pero teniendo en cuenta apropiadamente los datos censurados.
20
Q
Modelo de Cox o riesgos proporcionales:
A
probabilidad de que a un individuo que ha sobrevivido hasta el tiempo t, le ocurra el evento de interés en el próximo instante.
21
Q
El análisis de la supervivencia permite analizar el tiempo T hasta un determinado evento de interés. Deben definirse muy claramente:
A
El tiempo cero al inicio del estudio, T0: diagnóstico,intervención, inicio de tratamiento, randomización, etc.
El suceso de interés, E: muerte, recurrencia, rechazo, etc.
Entonces, el tiempo de supervivencia T es el tiempotranscurrido entre T0 y el momento en que se produce E.
22
Q
Validación aparente
A
Se analiza el comportamiento del modelo sobre los mismos datos que se han utilizado para generarlo.
23
Q
Validación interna:
A
Se analiza el comportamiento del modelo sobre una muestra de la misma población que los datos que se han utilizado para generar el modelo.
24
Q
Validación externa:
A
El objetivo es analizar la generalización del modelo a poblaciones similares a la que ha servido para generar el modelo. Se analiza el comportamiento del modelo sobre una o varias muestras independientes a la muestra utilizada para generar el modelo.
25
El balance final de la interacción entre las células neoplásicas y el sistema inmune depende de un escenario complejo donde computan:
- Carga mutacional del tumor
- Generación de neoantígenos
- Expresión de moléculas implicadas en el MHC-I y MHC-II
- Células T reguladoras
- Células T citotóxicas
- Presencia y balance de macrófagos pro-inflamatorios/Macrófagos reguladores
- Actividad TFG-beta en el microambiente
- Tratamientos previos
- Índice proliferativo del tumor
- Modelado del sistema inmune a través de la flora intestinal
26
Tumores con alta afinidad a terapia dirigida contra el checkpoint immune son:
* Tumores con alta carga mutacional
* Tumores con amplificación de la región cromosómica 9p24
* Tumores que expresan antígenos virales
* En general, tumores cálidos, tumores con alto contenido de células inflamatorias.
27
marcadores potenciales de sensibilidad/resistencia a terapia dirigida contra el checkpoint immune son:
• Mutaciones con pérdida de función de JAK1 o JAK2
• pérdida de expresión de Beta-2-microglobulina
• Alteraciones en MDM2/MDM4 y EGFR
• Mutaciones de P53
• Pérdida de expresión de PTEN
• Expresión aberrante de PD-L1 debida a disrupción de 3-UTR
• Mutaciones con pérdida de función en el receptor de Apelina (interactuando on JAK1)
28
Para estudiar el orden exacto o secuencia del ADN de una persona, fundamentalmente son necesarios tres pasos:
1) aislar y purificar el ADN de un tejido o de células, 2) amplificar el ADN o las secuencias de interés con unos cebadores específicos, y 3) leer la secuencia y compararla con otras.
29
Mutación puntual:
es una ganancia, pérdida o cambio de un único par de bases. Aunque la mayoría de las mutaciones puntuales son benignas, también pueden tener diversas consecuencias funcionales, como cambios en la expresión génica o alteraciones en las proteínas codificadas.
30
Deleción:
es un tipo de mutación que implica la pérdida de uno o más nucleótidos de un segmento de
ADN, desde un solo nucleótido hasta un fragmento cromosómico.
31
Mutación frameshift o con cambio del marco de lectura:
es una inserción o deleción de bases nucleotídicas en números que no son múltiplos de tres. Si una mutación altera el marco de lectura normal, toda la secuencia genética que sigue a la mutación se leerá incorrectamente. Esto puede dar lugar a la incorporación de aminoácidos erróneos a la proteína y/o a la creación de un codón stop prematuro.
32
Inserción:
es un tipo de mutación que implica la ganancia de uno o más nucleótidos en un segmento de
ADN, desde un solo nucleótido hasta un fragmento cromosómico.
33
Polimorfismo:
es una variante genómica, es decir, dos o más patrones de una secuencia específica de ADN que varían entre individuos o poblaciones. El tipo más común de polimorfismo es la variación de un solo nucleótido o single nucleotide polymorphism (SNP). Otros polimorfismos pueden afectar segmentos más largos de ADN.
34
Variante estructural (SV, structural variant):
variante en la estructura cromosómica que afecta una longitud de secuencia de entre 50bp a 3Mbp. Las SVs incluyen deleciones, duplicaciones, variantes en el número de copias, inserciones, inversiones y translocaciones, algunas de las cuales se asocian a enfermedades genéticas. Sin embargo, la mayoría de las SVs son polimorfismos, es decir, variantes que determinan la variabilidad genómica entre individuos y poblaciones.
35
Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR):
Su objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento concreto de ADN partiendo de un mínimo; en teoría basta con partir de una única copia de ese fragmento original o molde.
36
Secuenciación Sanger (método de terminación de cadena):
incorporación aleatoria por una enzima ADN polimerasa de dideoxinucleótidos (ddNTP) de terminación de cadena durante la replicación in vitro del ADN. Los dideoxinucleótidos de terminación de cadena carecen de un grupo 3'-OH necesario para la formación de un enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos, lo que hace que la ADN polimerasa cese la extensión del ADN cuando se incorpora un ddNTP modificado.
37
Secuenciación de nueva generación o Next-Generation Ssequencing (NGS):
(NGS): tecnología de secuenciación masiva en paralelo del ADN que permite analizar el genoma completo, los exones de todos los genes conocidos (exoma completo) o sólo los exones de genes seleccionados (panel de genes). La NGS de ADN implica la fragmentación del ADN, preparación de librerías (exoma, genoma, paneles), secuenciación paralela masiva, un análisis bioinformático y la anotación e interpretación de variantes/mutaciones.
38
Secuenciación del ADN por nanoporos (Nanopore Sequencing):
consiste en leer el código de una sola cadena de ADN cuando ésta atraviesa unos poros minúsculos (nanoporos) incrustados en una membrana. A medida que el ADN se desplaza por el poro, se producen pequeños cambios en la corriente eléctrica que se traducen en la lectura de los diferentes nucleótidos del ADN. Este método permite estudiar cadenas largas de ADN con rapidez y bajo coste.
39
PCR digital:
es una reacción en cadena de la polimerasa en la que la muestra se fracciona primero en muchos subvolúmenes (en micropocillos, cámaras o gotitas) de forma que cada fracción contiene pocas o ninguna secuencia diana. Tras la PCR, la proporción de fracciones con amplificación positiva sirve para calcular la concentración de la secuencia diana mediante un análisis estadístico (distribución de Poisson).
40
Multiplex Ligation dependent Probe Amplification (MLPA):
técnica de PCR multiplex que utiliza un único par de cebadores para amplificar hasta 60 sondas, cada una con una diana genómica y una longitud única. Los amplicones de la PCR se marcan con fluorescencia y se separan y cuantifican mediante electroforesis capilar. Comparando el patrón de picos resultante de una muestra con los de un conjunto de muestras de referencia, se puede determinar el número de dianas genómicas presentes en la muestra de interés. Esta técnica se utiliza para estudiar las variaciones en el número de copias (CNV) de genes asociadas a enfermedades, pudiendo detectar CNVs que comprenden desde exones individuales a cromosomas completos.
41
La conversión bisulfito del ADN
es la desaminación de las citosinas no metiladas a uracilo, dejando las bases metiladas 5-mC y 5-hmC. Este procedimiento puede ir seguido de amplificación por PCR o métodos de secuenciación masiva en paralelo para determinar el patrón de metilación de cada citosina en genes específicos o en todo el genoma.
La metilación del ADN fue la primera marca epigenética descubierta. La presencia de un grupo metilo en la posición del carbono 5 de los residuos de citosina de dinucleótidos CpG de la región promotora de un gen se asocia a la represión de la transcripción del dicho gen.
42
Fluorescence in situ Hybridization (FISH):
técnica basada en la hibridación del ADN nuclear de células interfásicas o de cromosomas metafásicos fijados a un cristal, con una sonda de ácido nucleico. Las sondas se marcan indirectamente con un hapteno o directamente mediante la incorporación de un fluoróforo. Se utiliza para diagnosticar enfermedades genéticas, cartografiar genes e identificar anomalías cromosómicas, y también para detectar inversiones y traslocaciones cromosómicas.
43
Mapeo óptico genómico (Optical Genome Mapping, OGM)
Nos permite analizar grandes fragmentos de ADN de manera directa sin necesidad de amplificar la muestra
es una técnica de análisis genómico que se basa en la hibridación de sondas marcadas con fluorescencia para detectar variantes y anomalías estructurales cromosómicas tales como duplicaciones, translocaciones, deleciones e inversiones a partir del ADN de sangre periférica, tejido fresco o cultivos celulares.
44
Las técnicas NGS se pueden dividir en dos grandes grupos:
las que generan lecturas cortas (<300 bases) y las que generan lecturas largas (>10.000 bases).
45
Características técnicas NGS de lecturas cortas
técnicas basadas en lecturas cortas, como Illumina y IonTorrent, tienen una tasa de error muy baja, por lo que suelen ser las más empleadas para secuenciación de muestras con el objeto de detectar mutaciones.
46
Características técnicas NGS de lecturas largas
las técnicas basadas en lecturas largas, como la tecnología SMRT de PacBio y la secuenciación por nanoporos de Oxford Nanopore, permiten obtener lecturas muy largas, de gran utilidad para muchos estudios, pero su tasa de error es demasiado elevada, no permitiendo su uso para la detección de mutaciones de cara al diagnóstico.
47
formato FASTQ,
Los resultados de secuenciación masiva se suelen almacenar en formato FASTQ, que contiene el nombre de la secuencia, la secuencia obtenida, así como la calidad de cada base, expresada en un tipo de puntuación llamado Phred Score, que representa la probabilidad de que dicha base esté mal. Este tipo de información es de gran importancia para la identificación de variantes posteriores.
48
profundidad de secuencia, o profundidad de cobertura
Cuando se emplean técnicas NGS, uno de los parámetros más importantes a tener en cuenta es la profundidad de secuencia, o profundidad de cobertura. Indica el número de veces que de media se lee/secuencia cada base. Es un parámetro de gran relevancia ya que, a mayor profundidad, mayor capacidad se tendrá para detectar variantes, y más seguro se estará de que esa variante es real. Pero al mismo tiempo, más coste económico tendrá la secuenciación. Para un genoma completo se suele emplear una profundidad de 30X, para exoma 100-200X, y para paneles se suele estar en el orden de 500-1.000X, aunque estos parámetros pueden variar dependiendo del tipo de estudio a realizar.
49
la calidad del DNA para NGS
Los tejidos o muestras tumorales frescas o congeladas son mucho mejores que las muestras procedentes de bloques de parafina fijados. Esta fijación provoca roturas del DNA y modificación química de las bases, provocando la aparición de numerosos errores.
50
Las etapas de análisis de datos derivados de NGS consisten en:
alinear las lecturas al genoma de referencia, generar un fichero BAM, llevar a cabo el análisis del fichero BAM para detectar variantes, y explorar dichas variantes para detectar mutaciones que pudieran ser patogénicas.
51
Las lecturas alineadas al genoma de referencia se almacenan en un formato específico denominado
SAM (Sequence Alignment Map format) o BAM (su versión binaria y comprimida). Este fichero BAM contiene toda la información proveniente de la secuenciación (nombre de secuencia, secuencia y calidad de las bases) así como la información sobre dónde alinea cada lectura al genoma de referencia, cómo de seguros estamos que dicha lectura alinea en esa posición, dónde alinea la lectura pareada, en qué orientación están ambas lecturas...
52
Los parámetros que afectan a la identificación de variantes son:
tasa de error (discriminar entre variantes reales y errores)
Calidad de la base (proporcionada por el instrumento)
Calidad de mapeo (cómo de seguro se está de que la lectura alinea en esa posición del genoma)
profundidad de lectura (a mayor número de lecturas, mayor potencia estadística para detectar variantes).
53
Los factores que afectan a la detección de mutaciones en muestras tumorales son
la profundidad, calidad de base y mapeo (como en la detección de variantes germinales), pero también la pureza tumoral (si hay células normales en el tumor se dificulta la detección), la pureza de la muestra no tumoral (presencia de células tumorales en el normal), y la presencia de mutaciones subclonales (su detección se dificulta a medida que el porcentaje de células con mutación disminuye).
54
PCR cuantitativa (qPCR)
se puede ver y cuantificar en tiempo real la amplificación del transcrito de interés al usar marcadores fluorescentes cuya emisión puede detectarse y medirse en cada ciclo de la reacción de PCR y que es proporcional a la cantidad de ADN amplificado de interés.
55
PCR clásica
los oligos o primers se sitúan en ambos sentidos y se copia la doble cadena de ADN mediante los pasos de desnaturalización del ADN, anillamiento de los primers y amplificación, repetido un número determinado de ciclos. Permite detectar la cantidad de producto amplificado al final de la reacción.
56
nCounter-nanoString
* La característica principal es que esta metodología no necesita retro transcripción, no utiliza enzimas, ni amplificación.
* Es una plataforma automatizada; con este sistema se hibridan sondas con barcodes o códigos de barra únicos y específicos de secuencia y que permiten una cuantificación digital del número de copias. Se unen directamente a la secuencia diana permitiendo la cuantificación absoluta, sin amplificación, de hasta 800 dianas diferentes.
* Se necesitan dos sondas específicas del gen a analizar: una con el “código de barras” específico del gen concreto y la otra unida a biotina que serviría para la captura.
* Es aplicable a ARN extraído de tejido fijado en formol y embebido en parafina.
57
HTG EdgeSeq
* Este sistema está basado en técnicas de secuenciación masiva. Se caracteriza porque no es necesario un procesamiento previo de la muestra para extraer el ARN, sólo un paso de lisis de la muestra. Está basado en hibridación con sondas específicas de secuencia y protección frente a nucleasas que permite la detección de fragmentos de ARN de aproximadamente 50nt, por lo que es válida también para ARN extraído de tejido fijado en formol y embebido en parafina.
58
Ventajas RNA-seq
datos más robustos que los microarrays
permite la detección de transcritos con muy bajos niveles de expresión
Es más preciso (evita “cross-hibridaciones”)
no está limitado a genes seleccionados.
Permite análisis adicionales, además de los de expresión génica, como son detección de transcritos de fusión, transcritos alternativos y mutaciones.
59
Técnicas análisis genético de bajo rendimiento
PCR clásica
PCR cuantitativa qPCR
60
Técnicas de análisis genético de rendimiento medio
nCounter-nanoString
HTG EdgeSeq
61
Técnicas de análisis genético de alto rendimiento
RNA-seq
62
metilación del promotor de genes supresores de tumores
inactiva la función supresora de estos genes. Trombospondina 1, p14 o p16 suelen aparecer metilados.
63
BRCA1 en cáncer de mama y ovario esporádico
BRCA1 no está mutado en cáncer de mama y ovario esporádico, sino que está metilado. El perfil de expresión de BRCA1 mutado (en cáncer de mama y ovario familiar) es igual al perfil de expresión de BRCA1 metilado. Esto permite que la pacientes con BRCA1 metilado se les apliquen las mismas estrategias terapéuticas que a los pacientes con BRCA1 mutado y por tanto son sensibles al tratamiento con inhibidores de PARP o a fármacos que inducen daño en la doble cadena, como cisplatino. No obstante, los pacientes con BRCA1 metilado también pueden desarrollar resistencia a estos tratamientos, por la aparición de deleciones intragénicas, la desmetilación del promotor o la aparición de genes de fusión que implican el control de BRCA1 con otro promotor. La aparición de resistencias también puede deberse a la metilación de genes que codifican para proteínas que interaccionan con BRCA1.
64
metilación de DELR3
La metilación de DELR3 impide la degradación de GLUT1 en células tumorales, favoreciendo la glicolisis. Tumores con DELR3 metilado son vulnerables a inhibidores de PKM2. El cáncer de hígado depende de esta metilación, abriendo nuevas opciones terapéuticas.
65
promotor alternativo de TBC1D16
Se han identificado cambios epigenéticos en la metástasis que no están en el tumor primario. El promotor alternativo de TBC1D16 se desmetila en la metástasis e induce la aparición de una isoforma del gen muy metastásica y reduce los niveles de EFGR. Los pacientes con esta isoforma son sensibles a inhibidores de BRAF y MEK.
66
¿Qué análisis puede ayudar a identificar el origen de los tumores de origen desconocido?
Se ha descubierto que el patrón de metilación es específico de cada tumor.
67
Ventajas citometría de flujo
análisis de subpoblaciones celulares; análisis de entre 10.000 y 20.000 eventos por segundo; separación celular (recuperación de subpoblaciones celulares de interés).
68
Inconvenientes citometría de flujo
Citometría “convencional”
- se pierde la información espacial, no se puede saber si la medida de fluorescencia observada está en el núcleo o en el citoplasma, por lo que esta técnica debe ser complementaria a la microscopia.
En la actualidad hay diversos equipos comerciales con capacidad de imagen mediante cámaras u algoritmos matemáticos que reconstruyen la imagen desde el “waveform” generado al pasar la partícula frente al beam del láser.
69
EGFR exon 20 insertions (EGFRins20)
3rd most frequent EGFR activating mutation(~10%).
Taken separately, they represent ~1-2% of driver mutations in non-squamous NSCLCs.
Fármaco: amivantamab (biespecífco antiEGFR y MET activador de sistema inmune)
70
In NSCLC, HER2 amplification occur in...
<15% of cases, and insertion mutations in exon 20 in 2- 6% of patients with EGFR/KRAS/ALK-negative lung adenocarcinomas.
71
Neuroregulins (NRGs) 1 to 4: ¿Qué son?
ligands of ERBB3 and ERBB4 growth factors receptors.
72
Gene Fusion Detection: DNA vs RNA NGS Testing
RNA-based NGS can detect fusion missed by DNA-based NGS: ALK, ROS1, RET, NTRK, NRG1
73
Motivos por los cuáles el NGS basado en DNA puede no detectar fusiones:
Intrones largos (demasiada secuenciación, con en el RNA no hay que hacer porque no tiene intrones).
Intrones repetidos
Baja muestra tumoral
Eventos genómicos complejos
74
Fuentes de análisis genético en biopsia líquida
Tumor “Educated” Platelets
Exosomes
CTCs
Circulating Tumor DNA (ctDNA)
75
Qué quiere decir esta frase: 1% VAF: ~100 tumor genomic equivalents (typical detection limit of most ctDNA assays)
Para detectar una variante con un VAF de 1%, la muestra debe contener aproximadamente 100 copias genómicas derivadas del tumor. En otras palabras, si en la muestra de ctDNA hay 10,000 moléculas totales de ADN, 100 de ellas deben ser de origen tumoral para alcanzar este nivel de detección.
76
LAG-3 (Lymphocyte activation gene 3) expression
LAG-3 expression associates with immunosuppression, among others, deactivating and inhibiting proliferation of T and NK cells.
77
Major Pathologic Response (MPR)
* ≤ 10% for all histologic types
* primary tumors only, lymph nodes not included in the assessment
* Two assessments:
* Weighted: with assessment of tumor + tumor bed tissue proportion in the slide
* Unweighted: without
78
Methods for proteins detection
s ELISA
s Gel Electrophoresis
s Western blot
s Immunoprecipitation
s Spectrophotometry
s Enzyme assays
s X-ray crystallography
s NMR
s Immunohistochemistry
79
Marcadores B cells
CD 19, CD20, CD 79
80
Marcadores T cells
CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, Cytotoxic molecules
81
Plasma cell markers
CD138, CD38
82
VpreB3
A) VpreB3 marca una proporción de Germinal Center B cells
B) VpreB3 sirve como marcador para el linfoma de burkitt y de asocia con alteraciones de Myc en LDCGB
C) VpreB3 tiene un extremo valor predictivo negativo para las translocaciones de cMyc en tumores células B agresivos (NPV=.98). Por lo tanto , es un test de screening útil
83
Granulysin (GNLY)
marker for NK/T-cells
GNLY expression widely correlates with good outcomes in a variety of cancers including colorectal carcinoma, gastric carcinoma and neuroblastoma
Low intracellular expression of GNLY (but not perforin) In CD3-/CD16+ cells correlates with progression of cancer.
Además, puede servir como biomarcador para el diagnóstico del ENKTL
84
Tumour mutational burden
Checkmate 227, 10 mutations per mega base (mut/Mb) in NSCLC treated with ICIs.
* Independent of PDL1 expression, consistently with the results of Checkmate 568
* TMB is not a binary marker, and its predictive capacity differs between specific tumour types
* Patients with low TMB may respond to ICIs
85
Diferencias polimorfismo y mutación
Frecuencia >1% vs <1%
No asociado con fenotipos o bajo riesgo vs asociado con una enfermedad
Siempre germline vs somáticas o germline
Eventos antiguos vs eventos recientes
86
Chromothripsis
Alternation of copy number changes in same chromosome
Chromosome was fragmented into many pieces, and DNA repair fused wrong ends and deleted some fragments
87
Tipos ARN
Codificante (mensajero)
Básico
Regulador
88
Tipos ARN básico
* ARN de transferencia (tRNA o ARNt)
* ARN ribosómico (rRNA o ARNr)
* ARN nucleolar (snoRNA)
* pequeños ARN nucleares (snRNA), implicados en splicing
* ARN de la telomerasa
89
Tipos ARN reguladores
* miARN
* lncARN
* circ ARN, piARN
90
La clave en la PCR cuantitativa es
la posibilidad de detectar en tiempo real la amplificación del transcrito de interés por medio de emisión de fluorescencia
La cuantificación de la fluorescencia emitida durante cada ciclo de la PCR será proporcional a la cantidad de ADN que se está amplificando.
91
Aplicaciones de la qPCR
▪Cuantificación de la expresión génica: ARN
▪Enfermedad mínima residual: ARN o ADN
▪Carga viral: ARN o ADN
▪Cuantificación miARNs: ARN
▪Discriminación alélica (SNVs): ADN
▪Duplicación o deleción génica: ADN
92
nCounter (NanoString) es
una plataforma automatizada; con este sistema se hibridan sondas con “códigos de barra” únicos y específicos de secuencia. Se unen directamente a la secuencia diana permitiendo la cuantificación absoluta, sin amplificación
93
Ventajas nCounter (NanoString)
* No necesita retro-transcripción, ni enzimas, ni amplificación
* Permite analizar distintas muestras: ARN total, lisados celulares, muestras parafinadas...
* Cuantificación digital
* Rango lineal desde 7 a 105 unidades
* Útil para expresión (ARNm, microARN, lncARN),
94
transcriptoma
representa todo el ARNm de forma global, transcrito bajo unas circunstancias y condiciones determinadas.
95
Ventajas del RNA-seq
* Detección de transcritos de fusión
* Splicing (procesamiento) alternativo
* Detección de mutaciones somáticas o SNP en los transcritos expresados
* Perfiles de expresión de ARN de baja expresión
* Perfiles de expresión de ARNs pequeños
96
¿Qué aporta la RNA-seq frente a los microarrays?
➢ Los datos son más robustos, reproducibles y “cuantificables”
➢ Tiene un rango dinámico de expresión mayor (1 -> 8000).
➢ Permite la detección de transcritos con muy bajos niveles de expresión
➢ Es más preciso (evita hibridaciones cruzadas o inespecíficas)
➢ No está limitado a genes seleccionados: análisis sin sesgos
➢ Puede realizarse sobre paneles específicos (rutas, patologías, customizados)
➢ Con nuevas aplicaciones además de estudios de expresión
97
Objetivos de análisis de la expresión génica
Comparación de clases (DIFFERENTIAL EXPRESSION ANALYSIS) Por ejemplo, la comparación entre dos tipos histológicos del mismo tumor (t-test, anova...): identificación de genes que se expresan de forma diferencial. * Normal vs. tumoral * Agresivo vs. indolente * Tipo tumoral A vs. tipo tumoral B * Respondedor vs. no respondedor
Descubrimiento de clases (CLUSTERING) Agrupar genes y/o muestras por perfiles de expresión similares
Predicción de clases (PREDICTOR) Partiendo de grupos definidos crear modelo o “clasificador” que clasifique correctamente las muestras en grupos establecidos
98
Comparación de clases, el Fold-change:
Ratio de expresión entre 2 grupos (ie. Tumor/control)
- Los genes se seleccionan si superan una determinada ratio.
- Pero la significancia de este cambio depende de la variabilidad dentro del grupo, entre los grupos y además, dicha variabilidad es diferente para cada gen
El fold-change no es suficiente, hay que realizar un análisis estadístico de dicha variabilidad
99
¿qué podemos analizar con estudios de transcriptómica espacial?
permite estudiar la expresión génica en su contexto espacial, crucial para entender la organización y función de los tejidos
* Tipo celulares presentes en una muestra y su localización
* Características de poblaciones celulares no identificadas, interacciones tumor/microambiente tumoral/células inmunes...
* Identificación de regiones específicas de heterogeneidad: borde MAT-tumor
100
PARPi-resistant breast PDX tumors
BRCA1 intragenic deletions
BRCA1 promoter demethylation
BRCA1 gene fusions that placed BRCA1 under the transcriptional control of a different promoter
101
Name potential markers for acquired resistance to immunotherapy.
*
loss-of-function mutations in JAK1 or JAK2
*
Beta-2-microglobulin truncation
*
MDM2/MDM4 and EGFR alterations
*
P53 mutations
*
PTEN loss
*
Aberrant PD-L1 expression through 3-UTR disruption
*
Loss of function mutation in Apelin receptor (JAK1 interacting)
102
What is a pre-metastatic niche?
A pre-metastatic niche is a site in the body prepared by the primary tumour to be receptive to the arrival of metastatic cells. It involves changes in the tissue microenvironment, making it favourable for cancer cell colonisation
103
What role do exosomes play in metastasis?
Exosomes are extracellular vesicles that can transfer molecules between cells, including cancer cells. They can promote metastasis by preparing pre-metastatic niches, influencing organotropism, and educating bone marrow cells to support tumour growth
104
How does S100A9 cause radioresistance?
The tumour microenvironment induces S100A9 expression. Secreted S100A9 signals through RAGE-NFκB-JunB in cancer cells to induce radioresistance.
105
How does CTLA-4 inhibit T cells?
It binds to B7 ligands with higher affinity than CD28, outcompeting CD28 for these ligands and thus preventing T cell activation.
106
How does PD-1 inhibit T cells?
When phosphorylated, it recruits SHP-2, which inhibits the PI3K/Akt and MEKK/Erk pathways, leading to reduced T cell activation and cytokine production
107
How do CTLs kill tumour cells?
By releasing granules containing perforin and granzymes, and by expressing FAS-L, which induces apoptosis in tumour cells.
108
What is OGM used for?
Optical Genome Mapping (OGM) is a technique used to detect structural variants and chromosomal abnormalities, such as duplications, translocations, deletions and inversions, from DNA samples.
109
¿Qué son los microarrays?
Los microarrays son herramientas de laboratorio utilizadas para analizar la expresión de genes o detectar variaciones genéticas de manera simultánea y a gran escala. Son como "chips" que contienen miles de pequeñas sondas (fragmentos de ADN o ARN) organizadas en un formato rectangular o cuadrado, permitiendo estudiar cientos o miles de genes a la vez.
Ventajas
Permiten analizar miles de genes o variantes a la vez.
Son rápidos y relativamente económicos comparados con otras tecnologías.
Ofrecen una visión global de la actividad genética o cambios genómicos.
Limitaciones
Requieren conocimiento previo de las secuencias genéticas que se quieren estudiar.
Tienen menor resolución y precisión en comparación con tecnologías más recientes, como la secuenciación de nueva generación (NGS).
Pueden generar ruido en los datos, lo que dificulta su interpretación.
110
Compare polychromatic and spectral cytometry.
Polychromatic cytometry uses bandpass filters to direct specific wavelengths of light to detectors. It has limitations when fluorochromes have overlapping emissions. Spectral cytometry collects the entire spectrum of emitted light, allowing for more complex panels with overlapping fluorochromes.
111
¿Cómo funciona Northern blot?
Northern blot funciona separando moléculas de ARN por electroforesis en gel, transfiriéndolas a una membrana y detectándolas mediante sondas complementarias marcadas
112
Which of the following techniques allows for the analysis of gene expression in the context of its spatial location within a tissue sample?
a) qPCR
b) nCounter
c) RNA-seq
d) **Spatial transcriptomics**
**Spatial transcriptomics** combines gene expression data with spatial information, allowing researchers to study how gene expression varies across different regions of a tissue. This technique is crucial for understanding the organisation and function of tissues, and it can be used to identify cell types, characterise cell populations, and study interactions between different cell types. Some of the applications of spatial transcriptomics include the identification of specific regions of heterogeneity, such as the tumour-microenvironment border. The sources provide examples of different platforms and techniques for spatial transcriptomics, including GeoMX Nanostring and Visium 10x Genomics
113
Which of the following statements about RNA sequencing (RNA-seq) is **NOT** supported by the sources?
a) RNA-seq is a high-throughput technique that allows for the analysis of thousands of genes simultaneously.
b) RNA-seq can be used to detect fusion transcripts, alternative splicing events, and somatic mutations.
c) RNA-seq requires prior knowledge of the genes of interest and is limited to analysing selected genes.
d) RNA-seq data is generally considered to be more robust, reproducible, and quantifiable than data from microarray analysis.
The correct answer is **c) RNA-seq requires prior knowledge of the genes of interest and is limited to analysing selected genes.**
RNA-seq is **not** limited to pre-selected genes. It can be used to analyse the entire transcriptome, including novel transcripts. The sources highlight that RNA-seq allows for "analysis without bias" because it is "not limited to selected genes." You can also perform RNA-seq on specific panels, such as for particular pathways, diseases, or custom panels.
Here's why the other options are correct:
* **a) RNA-seq is a high-throughput technique that allows for the analysis of thousands of genes simultaneously.** This statement is supported by the sources.
* **b) RNA-seq can be used to detect fusion transcripts, alternative splicing events, and somatic mutations.** The sources mention these as some of the advantages of using RNA-seq.
* **d) RNA-seq data is generally considered to be more robust, reproducible, and quantifiable than data from microarray analysis.** The sources state that RNA-seq "provides more robust data than classic microarrays" and that the data is "reproducible and 'quantifiable
114
Which of the following techniques does **NOT** require reverse transcription of RNA to cDNA for gene expression analysis?
a) nCounter Nanostring
b) qPCR
c) RNA-seq
d) HTG EdgeSeq
The correct answer is **a) nCounter Nanostring**.
The **nCounter Nanostring** technology is highlighted in the sources for its unique characteristic of directly measuring RNA molecules without the need for reverse transcription or amplification. This method uses probes with unique "barcodes" that hybridise directly to the target RNA sequences, allowing for absolute quantification of up to 800 targets simultaneously.
All the other options require a reverse transcription step to convert RNA to cDNA before further analysis:
* **qPCR** relies on the amplification of cDNA, which is produced from RNA through reverse transcription using an enzyme called reverse transcriptase. The amplified cDNA is then detected and quantified using fluorescent dyes or probes.
* **RNA-seq** involves converting the RNA into a library of cDNA fragments that are then sequenced. The sequencing reads are then mapped to a reference genome or transcriptome, and the expression level of each gene is determined by counting the number of reads that map to that gene.
* **HTG EdgeSeq** is also based on next-generation sequencing (NGS) technology. It utilises a nuclease protection method that targets specific RNA sequences with probes. While the sources do not explicitly mention reverse transcription for this technique, the underlying principle of NGS and the fact that it is "based on hybridisation with sequence-specific probes and nuclease protection" strongly suggest that cDNA synthesis is a necessary step in this process
115
Which of the following epigenetic modifications is **most frequently** associated with the silencing of tumour suppressor genes in cancer, as discussed in the sources?
a) Histone acetylation
b) DNA methylation
c) Histone methylation
d) RNA interference
The correct answer is **b) DNA methylation**. The sources specifically mention that **DNA methylation** is the most basic epigenetic mark and its effect is frequently the modification of gene expression, including the silencing of repetitive sequences. They further state that **methylation of the promoter of tumour suppressor genes inactivates their suppressor function**, contributing to the development of cancer.
116
*¿Cómo realiza la secuenciación el NGS?*
El *NGS* (Next Generation Sequencing) utiliza métodos avanzados para secuenciar ADN de manera paralela. Primero, el ADN se fragmenta en piezas más pequeñas. Luego, cada fragmento se amplifica y se coloca en una superficie de secuenciación. A través de reacciones químicas y la detección de señales ópticas, se determina la secuencia de nucleótidos de cada fragmento simultáneamente. Este proceso permite generar millones de lecturas en un solo experimento, facilitando
el análisis genómico a gran escala
117
Diferencia cfDNA y ctDNA
cell free DNA
circulating tumour DNA
118
¿Qué anticuerpo se usa en cáncer de pulmón y gástrico para la IHQ de PDL1?
Dako 22c3
119
Puntos a tener en cuenta en la IHQ de PDL1 en cáncer de pulmón
1. Sólo la tinción de la membrana es positiva
2. Sólo se cuentan las células tumorales
3. Cualquier intensidad de tinción es positiva
4. El porcentaje de células tumorales de teñidas es lo importante
5. Debe haber al menos 100 células tumorales para que la interpretación sea válida
120
*¿Qué es la microdisección por captura láser?*
La *microdisección por captura láser* (LCM, por sus siglas en inglés) es una técnica avanzada utilizada para aislar células específicas de regiones microscópicas de tejido. Este método permite la recolección de subpoblaciones celulares bajo visualización microscópica directa, lo que es crucial para el análisis molecular y la investigación de enfermedades. Utilizando láseres, LCM preserva la integridad biológica de las muestras, facilitando estudios detallados sobre interacciones celulares y perfiles de expresión genética. Es especialmente útil en el contexto de tejidos heterogéneos, donde se requiere un enfoque preciso para entender la biología celular
121
*¿Qué es MLPA en genética?*
*MLPA*, o *Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification*, es una técnica utilizada en genética para detectar y cuantificar variaciones en el número de copias de secuencias específicas de ADN. Esta metodología permite analizar múltiples regiones genómicas simultáneamente, lo que la hace eficiente para estudiar deleciones o duplicaciones en genes, especialmente en enfermedades genéticas y cáncer. El proceso implica la hibridación de sondas específicas al ADN objetivo, seguido de una amplificación mediante PCR. Los resultados se analizan mediante electroforesis, proporcionando información valiosa sobre alteraciones genómicas que pueden ser relevantes para el diagnóstico y tratamiento.
122
Indique la respuesta correcta. En cáncer:
a.
La presencia de neoantígenos está relacionada con el índice mutacional
b.
Todas las opciones son correctas
c.
La respuesta inmune contra las células neoplásicas es dependiente de estos neoantígenos
d.
Mutaciones somáticas en las células cancerosas pueden generar neoantígenos
B
123
Indique la respuesta correcta. Volcano Plot:
a.
Permite analizar datos de alteraciones en número de copias y SNVs
b.
No se usa en análisis de datos derivados de estudios moleculares masivos
c.
Se usa para análisis de datos mutacionales después de estudio de NGS
d.
Se puede usar para analizar datos de expresión génica comparando dos condiciones
d
124
Indique la respuesta correcta. Mutaciones en precursores hematopoyéticos (CHIP) no son frecuentes en:
a.
Mielodisplasia
b.
Linfoma de Células T
c.
Leucemia Linfocítica Crónica
d.
Leucemia Mieloide Aguda
c
125
Indique la respuesta correcta. Diferentes estrategias de secuenciación masiva difieren en:
a.
Todas las opciones son correctas
b.
Profundidad de las lecturas
c.
Número de secuencias a analizar
d.
Coste del estudio
a
126
Indique la respuesta correcta. La presencia de una firma mutacional inducida por radiación UV es un rasgo de todas estas neoplasias, menos una:
a.
Melanoma
b.
Carcinoma de células de Merkel
c.
Mastocitosis cutánea
d.
Micosis Fungoide
c
127
Indique la respuesta correcta. Una alteración genética es considerada accionable si:
a.
Permite identificar el pronóstico
b.
Variación germinal que predice riesgo de desarrollar cáncer
c.
Facilita el diagnostico
d.
Permite predecir respuesta a terapia
d
128
Indique la respuesta correcta. “Transcriptional profiling” se refiere a:
a.
Variaciones germinales del genoma
b.
Cambios en la secuencia
c.
Alteraciones en número de copias
d.
Perfiles de expresión
d
129
Indique la respuesta INCORRECTA:
a.
La inestabilidad genómica está relacionada con la formación de neoepítopos
b.
El índice mutacional está relacionado con la formación de neoepítopos
c.
Los neoepítopos no generan respuesta inmune
d.
Cambios en la flora intestinal pueden regular la respuesta inmune en cáncer
c
130
Indique la respuesta correcta. La expresión de PDL1 en células tumorales:
a.
Es una determinación con muy baja utilidad para predecir respuesta a inmunoterapia
b.
La medida es dependiente del anticuerpo usado
c.
Puede ser citoplasmática o de superficie
d.
Es independiente de alteraciones genómicas
b
131
Indique la respuesta correcta. En Leucemia Linfocítica Crónica, terapias dirigidas tienen por diana, entre otros genes, a:
a.
PDL1/PDL2
b.
El gen frecuentemente mutado S3FB1
c.
La quinasa BTK
d.
El factor de transcripción NFkB
c
132
Indique la respuesta correcta. La predicción de respuesta a inmunoterapia en cáncer está basada en análisis de:
a.
Expresión de moléculas inmunoreguladoras
b.
Expresión de neoepítopos
c.
Todas las opciones son correctas
d.
Índice mutacional
c
133
Indique la respuesta correcta. PCR digital:
a.
Tiene una sensibilidad comparable a PCR
b.
Permite realizar una cuantificación absoluta
c.
Tiene numerosos falsos positivos
d.
No tiene aplicaciones clínicas, solo para investigación
b
Tiene más sensibilidad y pocos falsos positivos
134
Indique la respuesta correcta:
a.
La mayoría de los cánceres son diagnosticados en fases iniciales
b.
La mayor limitación de los estudios de biopsia líquida es la ausencia de tecnología sensible
c.
La mayor limitación de los estudios de biopsia líquida basados en detección de mutaciones es la variabilidad de genomas individuales de las personas sanas
d.
Los estudios de biopsia líquida no son aplicables a las formas comunes de cáncer
c
135
Indique la respuesta correcta. Una alteración genómica es considerada accionable si:
a.
Variación germinal que informe sobre toxicidad de drogas
b.
Es la diana de una intervención terapéutica
c.
Variación germinal que informe sobre metabolismo de drogas
d.
Afecta a la función de un gen relacionado con cáncer, aunque no se pueda usar como diana
b
136
Que es un microarray
Un microarray es como un chip de ADN que nos permite analizar miles de genes al mismo tiempo. Imagina una placa con miles de pequeñas sondas de ADN. Al poner una muestra en esta placa, podemos ver qué genes están activos y cuáles no, como una radiografía de nuestros genes.
137
Relevancia Clínica de la Inmunofluorescencia Multiplex para estudiar:
a) La co-expresión de moléculas presentes en el mismo compartimento subcelular,
b) La infiltración tumoral inflamatoria,
c) El fenotipo celular y el estado de activación,
d) Los cambios en las moléculas de puntos de control inmunológico,
e) La cuantificación y la proximidad.
138
Amplificación de 9p24, ¿que causa?
La amplificación de la región 9p24.1 es común en el linfoma de Hodgkin clásico, y esta amplificación incluye los genes PD-L1 (CD274) y PD-L2 (PDCD1LG2), que codifican proteínas que actúan como ligandos para PD-1, una molécula de punto de control inmunitario. Esta amplificación lleva a una sobreexpresión de PD-L1 y PD-L2, lo cual puede inhibir la respuesta inmune antitumoral, haciendo que estos tumores sean especialmente sensibles a los inhibidores de PD-1 o PD-L1, como pembrolizumab o nivolumab.
139
Diferencias 454 pyrosequencing, Ion Torrente e Illumina
454 Pyrosequencing (ya descontinuada) utilizaba enzimas para detectar la incorporación de nucleótidos a medida que se sintetizaba una nueva cadena de ADN, generando una señal de luz. Esta tecnología ofrecía lecturas más largas pero con un mayor índice de error.
Ion Torrent emplea semiconductores para detectar cambios en el pH cuando se incorpora un nucleótido, lo que resulta en una señal eléctrica. Esta tecnología ofrece un equilibrio entre longitud de lectura y tasa de error, siendo adecuada para una amplia gama de aplicaciones.
Illumina es la tecnología NGS más utilizada en la actualidad. Emplea fluoróforos unidos a los nucleótidos para detectar su incorporación. Esta tecnología destaca por su alta capacidad de procesamiento, generando millones de lecturas cortas y precisas en cada corrida.
140
Qué es el Phred Score
El Phred Score es una medida de la calidad de las bases en la secuenciación de ADN. Indica la probabilidad de error en la lectura de una base: Q = -10 log10(P), donde P es la probabilidad de error. Un score más alto significa mayor precisión.
141
Split reads
Split reads son lecturas de secuenciación que se alinean parcialmente al genoma de referencia, indicando puntos de ruptura en variaciones estructurales como deleciones, inserciones, inversiones o translocaciones. Son cruciales para identificar y mapear con precisión estos eventos genómicos en análisis de NGS.
142
Circos plots
son representaciones gráficas circulares que permiten visualizar relaciones y datos complejos de manera compacta y estética. Se usan en genomics para mostrar comparaciones genómicas, variaciones estructurales, y otros datos biológicos, facilitando la interpretación de grandes conjuntos de datos en un solo gráfico.
