7. Ανοσοενζυμική Δοκιμασία ELISA

Question 1

Τι είναι η ELISA;

Answer 1

Προσδιορισμός της ενζυμικής δράσης του συμπλέγματος αντιγόνου-αντισώματος-ενζύμου σε στερεή φάση

Question 2

Που στηρίζεται η αρχή των ανοσοενζυμικών δοκιμασιών;

Answer 2

Η αρχή των ανοσοενζυμικών δοκιμασιών στηρίζεται στην ανίχνευση του συμπλέγματος
αντιγόνου-αντισώματος (AgAb) με τη χρησιμοποίηση συγκεκριμένου συζεύγματος το
οποίο αποτελείται από ομόλογο αντίσωμα και ένα ένζυμο.
Η ενζυμική δραστικότητα ανιχνεύεται με την παραγωγή εγχρώμου προϊόντος μετά την
προσθήκη και την οξείδωση κατάλληλου δείκτη του ενζύμου (χρωμογόνο, υπόστρωμα). Η
ποσότητα του παραγόμενου έγχρωμου προϊόντος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του
ενζύμου, η οποία με τη σειρά της είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του ειδικού
αντισώματος που συνδέθηκε με το αντιγόνο.

Question 3

Πως λειτουργεί η ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΤΙΚΗ ELISA;

Answer 3

Οι ανταγωνιστικές ELISA χαρακτηρίζονται από τον ανταγωνισμό που αναπτύσσεται
μεταξύ του προς προσδιορισμό αντιγόνου και της σταθερής ποσότητας αντιγόνου (ή
αντισώματος) που έχει σημανθεί με ένζυμο, για συγκεκριμένο αριθμό θέσεων πρόσδεσης
επάνω στο ακινητοποιημένο αντίσωμα (ή αντιγόνο). Ο ποσοτικός προσδιορισμός του
αντιγόνου γίνεται με τη χρησιμοποίηση πρότυπης καμπύλης αναφοράς.

Question 4

Πως λειτουργεί η κλασσική έμμεση ELISA (μη ανταγωνιστική);

Answer 4

Ακινητοποιημένο αντιγόνο, από πάνω αντίσωμα, πάνω από αυτό αντι-αντίσωμα με ένζυμο, και τέλος προστίθεται το υπόστρωμα χρωμογόνο.

Question 5

Πώς λειτουργεί η ELISA σαντουιτς (μη ανταγωνιστική);

Answer 5

Ακινητοποιημένο αντίσωμα Α, προσθήκη αντιγόνου για προσδιορισμό, αντίσωμα Β σημασμένο με ένζυμο και τέλος υπόστρωμα - χρωμογόνο
Αντίσωμα Α και Β έχουν παραχθεί για το ίδιο αντιγόνο αλλά σε διαφορετικούς οργανισμούς

Question 6

Πως λειτουργεί η μη ανταγωνιστική τροποποιημενη ELISA;

Answer 6

ακινητοποιημένο αντίσωμα Α, αντιγόνο προς προσδιορισμό, αντίσωμα Β, ΑΝΤΙ - αντισωμα Β με ένζυμο, και τέλος προσθήκη υπόστρωμα - χρωμογόνο

Question 7

Από ποιους παράγοντες εξαρτάται η δοκιμασία ELISA;

Answer 7

Η επιτυχία της ELISA εξαρτάται από τους παρακάτω παράγοντες: (1) το αντιδραστήριο
που ακινητοποιείται στο στερεό υπόστρωμα, (2) το αντίσωμα που επιλέγεται, (3) την
παρασκευή του συζεύγματος, (4) το σύζευγμα και τον δείκτη του ενζύμου, και (5) τον
τρόπο ανίχνευσης του τελικού προϊόντος

Question 7

Από ποιους παράγοντες εξαρτάται η δοκιμασία ELISA;

Answer 7

Η επιτυχία της ELISA εξαρτάται από τους παρακάτω παράγοντες: (1) το αντιδραστήριο
που ακινητοποιείται στο στερεό υπόστρωμα, (2) το αντίσωμα που επιλέγεται, (3) την
παρασκευή του συζεύγματος, (4) το σύζευγμα και τον δείκτη του ενζύμου, και (5) τον
τρόπο ανίχνευσης του τελικού προϊόντος

Question 8

Πως αντιμετοπίζεται το πρόβλημα από τις διαφορές προσρόφησης του αντιδραστηρίου που
παρουσιάζονται μεταξύ των διαφορετικών πλαστικών επιφανειών ή ακόμη και μεταξύ των
φρεατίων της ίδιας πλάκας;

Answer 8

To πρόβλημα αντιμετωπίζεται με τη χρησιμοποίηση, κατά τη διάρκεια των επωάσεων ή των βημάτων έκπλυσης, απορρυπαντικών σε συνδυασμό με
πρωτεΐνες για τον περιορισμό της μη-ειδικής προσρόφησης.

Question 9

Πώς πραγματοποιείται η σύζευξη ενζύμου - αντισώματος (ή αντιγόνου);

Answer 9

Οι μέθοδοι βασίζονται στην ενεργοποίηση ποικίλων ενεργών ομάδων τόσο του ενζύμου, όσο και του αντιδραστηρίου (αντιγόνο ή αντίσωμα).
Η μέθοδος με υπεριωδικό Na βασίζεται στη σύνδεση των μορίων δια μέσου της υδατανθρακικής
περιοχής τους. Καθώς η υδατανθρακική περιοχή του μορίου δεν συμμετέχει συνήθως
ούτε στο ενεργό κέντρο του ενζύμου, αλλά ούτε στη σύνδεση αντιγόνου-αντισώματος, η
μέθοδος αυτή δίνει συζευκτικά συστήματα με λιγότερη απώλεια της ενζυμικής
δραστικότητας. Η μέθοδος αυτή έχει εφαρμοστεί για τη σύζευξη αντισώματος- υπεροξειδάσης.

Η γλουταραλδεΰδη μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε διαδικασία ενός σταδίου για την
παρασκευή όλων γενικά των συζευκτικών συστημάτων ELISA και σε διαδικασία δύο
σταδίων κυρίως για την παρασκευή συζευκτικού συστήματος αλκαλικής φωσφατάσης. Το
κύριο πλεονέκτημα της μεθόδου με τη χρήση γλουταραλδεΰδης είναι ότι το συζευκτικό
σύστημα αλκαλικής φωσφατάσης-αντισώματος που λαμβάνεται είναι ομοιογενές σε
ποσοστό πάνω από 90% και αποτελείται από ένα μόριο αλκαλικής φωσφατάσης και ένα
μόριο αντισώματος.

Question 10

Ποια τα πλεονεκτήματα της ELISA;

Answer 10

1) οπτική, γρήγορη εκτίμηση των αποτελεσμάτων
2) Απλή και σχετικά οικονομική φωτομέτρηση σε ελάχιστο
χρόνο
3) Σταθερότητα για αρκετό χρονικό διάστημα του
εγχρώμου προϊόντος μετά τον τερματισμό της ενζυμικής αντίδρασης