2. Απομόνωση IgG Flashcards
Πώς μπορούν να βρίσκονται τα αντισώματα;
Τα αντισώματα ή ανοσοσφαιρίνες παράγονται και εκκρίνονται από διαφοροποιημένα
Β λεμφοκύτταρα ως αποτέλεσμα της ενεργοποίησής τους από αντιγόνο. Τα αντισώματα
μπορούν να είναι είτε μεμβρανοσυνδεδεμένα (ανοσοσφαιρινικοί υποδοχείς των Β
λεμφοκυττάρων, BCR) είτε εκκριτικές γλυκοπρωτεΐνες (εκκριτικά προϊόντα των
πλασματοκυττάρων). Ως
μεμβρανοσυνδεδεμένες, οι ανοσοσφαιρίνες σχηματίζουν τους ανοσοσφαιρινικούς
υποδοχείς που έχουν όμοια ειδικότητα ως προς το αντιγόνο με τις ανοσοσφαιρίνες που
εκκρίνονται από τους αντίστοιχους κλώνους των Β λεμφοκυττάρων (πλασματοκυττάρων).
Οι εκκρινόμενες ανοσοσφαιρίνες αποτελούν συστατικά του πλάσματος.
Ποια αντισώματα εκκρίνονται στην πρωτογενή απόκριση και τι συμβαίνει σε αυτή;
Η πρώτη επαφή ενός ατόμου με ένα εξωγενές αντιγόνο προκαλεί την πρωτογενή
χυμική ανοσοαπόκριση, που χαρακτηρίζεται από την παραγωγή εκκριτικών
πλασματοκυττάρων και Β κυττάρων μνήμης και έπειτα αύξηση του τίτλου αντισωμάτων. Στην πρωτογενή απόκριση εκκρίνεται κυρίως IgM
που ακολουθείται από την έκκριση IgG
Τι συμβαίνει στη δευτερογενή απόκριση και ποια αντισώματα εκκρίνονται κυρίως;
Τα Β κύτταρα μνήμης που σχηματίζονται κατά την πρωτογενή απόκριση σταματούν να
διαιρούνται και εισέρχονται στη φάση G0 του κυτταρικού κύκλου. Τα κύτταρα αυτά έχουν
διάφορους χρόνους ημιζωής και μερικά διατηρούνται καθ’ όλη τη διάρκεια της ζωής του
ατόμου. Η δυνατότητα ανάπτυξης δευτερογενούς απόκρισης εξαρτάται από την παρουσία
ενός πληθυσμού Β κυττάρων μνήμης και Τ κυττάρων μνήμης.
Η δευτερογενής είναι πιο γρήγορη, ο τίτλος των αντισωμάτων είναι ψηλότερος και διαρκεί περισσότερο
περισσότερα Β κύτταρα ειδικά για ένα
συγκεκριμένο αντιγόνο (μεγαλύτερη συγγένεια και υψηλότερος τίτλος κατά 100-1000φορές). Μεγαλύτερη συγκέντρωση IgG από IgM
Πώς γίνεται η απομόνωση των ανοσοσφαιρινών;
Η ιοντοανταλλακτική χρωματογραφία είναι πολύ διαδεδομένη και χρήσιμη μέθοδος για
το διαχωρισμό των πρωτεϊνών και βασίζεται στο γεγονός ότι όλα τα βιολογικά μόρια είναι
πολικά ή μπορούν να ιονιστούν.
Οι ιοντοανταλλάκτες μπορούν να
έχουν είτε θετικά είτε αρνητικά φορτισμένες ομάδες. Οι θετικά φορτισμένοι ανταλλάκτες
δεσμεύουν αρνητικά φορτισμένα ιόντα (ανιόντα) που μπορούν να ανταλλαγούν και γι’
αυτό ονομάζονται ανιονικοί ανταλλάκτες. Αντίθετα, οι αρνητικά φορτισμένοι ανταλλάκτες
δεσμεύουν θετικά φορτισμένα ιόντα (κατιόντα) και γι’ αυτό ονομάζονται κατιονικοί
ανταλλάκτες
Ποια τα 2 στάδια για διαχωρισμό πρωτεινων στην ιοντοανταλλακτική χρωματογραφία;
Στο πρώτο στάδιο, τα μόρια συνδέονται με τον ανταλλάκτη με ηλεκτροστατικές δυνάμεις που αναπτύσσονται μεταξύ του επιφανειακού φορτίου του μορίου και των φορτισμένων ομάδων του ανταλλάκτη, αντικαθιστώντας τα συνδεδεμένα
ιόντα. Οι ουσίες που δεν συνδέονται, εκλούονται από τη στήλη μαζί με το ρυθμιστικό
διάλυμα έκλουσης. Στο δεύτερο στάδιο, οι ουσίες εκλούονται από τη στήλη και
διαχωρίζονται η μία από την άλλη
Πώς γίνεται η έκλουση των πρωτεινων;
α) με αύξηση της ιονικής ισχύος του ρυθμιστικού διαλύματος. Καθώς αυξάνεται η
συγκέντρωση των ιόντων του ρυθμιστικού διαλύματος (με προσθήκη κάποιου άλατος
όπως π.χ. NaCl ή KCl), τα ιόντα αυτά ανταγωνίζονται με τις πρωτεΐνες για τις κοινές
φορτισμένες ομάδες του υλικού της στήλης.
β) με μεταβολή του pH. Καθώς το pH του ρυθμιστικού διαλύματος πλησιάζει το
ισοηλεκτρικό σημείο κάθε πρωτεΐνης, το φορτίο της πρωτεΐνης μηδενίζεται και με αυτό
τον τρόπο, η πρωτεΐνη αποδεσμεύεται από το υλικό της στήλης.
Τι ιοντοαναταλλάκτης χρησιμοποιείται στην άσκηση;
Στη άσκηση αυτή θα χρησιμοποιηθεί ο ανιονικός ανταλλάκτης DEAE cellulose. Το υλικό
της στήλης εξισορροπείται σε συνθήκες pH και ιονικής ισχύος τέτοιες που επιτρέπουν σε
όλες τις πρωτεΐνες του ορού να δεσμεύονται εκτός των ανοσοσφαιρινών της τάξης G (IgG).
Ποιες είναι οι σημαντικότερες διαφορές των μεθόδων απομόνωσης που χρησιμοποιήσατε;
Για τον διαχωρισμό των ανοσοσφαιρινών της τάξης G χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της μαζικής απομόνωσης και η μέθοδος της χρωματογραφίας σε στήλη. Κατά την πρώτη μέθοδο, ο διαχωρισμός του διαλύματος των IgG από τον ιοαντοανταλλάκτη με τις υπόλοιπες πρωτεΐνες του ορού γίνεται με φυγοκέντρηση, καθώς οι IgG λόγω φορτίου δεν έλκονται από τον ιοντοανταλλάκτη . Το υπερκείμενο που δημιουργείται περιέχει τις ανοσοσφαιρίνες IgG. Από την άλλη στην μέθοδο της χρωματογραφίας σε στήλη η απομόνωση των ανοσοσφαιρινών της τάξης G γίνεται με έκλουση των μη συνδεδεμένων IgG στον ιοντοαντάλλακτη. Επίσης, αν και μπορούμε ίσως να το υποθέσουμε, δεν μπορούμε να γνωρίζουμε ακριβώς σε ποιο από τα κλάσματα βρίσκονται οι επιθυμητές μας πρωτεΐνες. Αντιθέτως, με τη μέθοδο της μαζικής απομόνωσης αναμένουμε οι IgG να βρίσκονται στο υπερκείμενο μετά την πρώτη φυγοκέντρηση. Τέλος, σημαντικό είναι να αναφερθεί ότι με τη μέθοδο της χρωματογραφίας σε στήλη μπορούμε εκτός από τις IgG να διαχωρίσουμε και άλλες πρωτεΐνες του ορού, εν αντιθέσει με τη μαζική απομόνωση, κατά την οποία όλες οι υπόλοιπες πρωτεΐνες του ορού συλλέγονται στο υπερκείμενο μετά τη δεύτερη απομόνωση ως ενιαίο διάλυμα.
Ποιες είναι οι σημαντικότερες διαφορές των μεθόδων απομόνωσης που χρησιμοποιήσατε;
Για τον διαχωρισμό των ανοσοσφαιρινών της τάξης G χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της μαζικής απομόνωσης και η μέθοδος της χρωματογραφίας σε στήλη. Κατά την πρώτη μέθοδο, ο διαχωρισμός του διαλύματος των IgG από τον ιοαντοανταλλάκτη με τις υπόλοιπες πρωτεΐνες του ορού γίνεται με φυγοκέντρηση, καθώς οι IgG λόγω φορτίου δεν έλκονται από τον ιοντοανταλλάκτη . Το υπερκείμενο που δημιουργείται περιέχει τις ανοσοσφαιρίνες IgG. Από την άλλη στην μέθοδο της χρωματογραφίας σε στήλη η απομόνωση των ανοσοσφαιρινών της τάξης G γίνεται με έκλουση των μη συνδεδεμένων IgG στον ιοντοαντάλλακτη. Επίσης, αν και μπορούμε ίσως να το υποθέσουμε, δεν μπορούμε να γνωρίζουμε ακριβώς σε ποιο από τα κλάσματα βρίσκονται οι επιθυμητές μας πρωτεΐνες. Αντιθέτως, με τη μέθοδο της μαζικής απομόνωσης αναμένουμε οι IgG να βρίσκονται στο υπερκείμενο μετά την πρώτη φυγοκέντρηση. Τέλος, σημαντικό είναι να αναφερθεί ότι με τη μέθοδο της χρωματογραφίας σε στήλη μπορούμε εκτός από τις IgG να διαχωρίσουμε και άλλες πρωτεΐνες του ορού, εν αντιθέσει με τη μαζική απομόνωση, κατά την οποία όλες οι υπόλοιπες πρωτεΐνες του ορού συλλέγονται στο υπερκείμενο μετά τη δεύτερη απομόνωση ως ενιαίο διάλυμα.
Πως θα μπορούσατε να ταυτοποιήσετε τa προϊόντα απομόνωσης στο σωλήνα Α της μαζικής ή στους σωλήνες 1-6 της χρωματογραφίας σε στήλες;
Προκειμένου να ταυτοποιηθούν τα προϊόντα απομόνωσης και στις δύο περιπτώσεις θα μπορούσαμε να χρησιμοποιήσουμε είτε τη μέθοδο της Ανοσοδιάχυσης ή της Aνοσοδοκιμασίας Western (Western blot). Με τη μέθοδο της Ανοσοδιάχυσης θα παρατηρούσαμε ορατό ίζημα σε ημιδιαπερατό μέσο εφόσον είχαν απομονωθεί οι ανοσοσφαιρίνες της τάξης G και δημιουργούσαν συμπλέγματα με τα ειδικά για αυτές αντισώματα. Με τη μέθοδο της Aνοσοδοκιμασίας Western, στο φύλλο νιτροκυτταρίνης ή PVDF μπορεί να διαπιστωθεί αν έχουν διαχωριστεί σωστά οι επιθυμητές πρωτεΐνες με βάση τις ζώνες (bands) που έχουν δημιουργηθεί.
