13. ΜLR ΜΙΚΤΗ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ

Question 1

Τι ονομάζουμε μικτή λεμφοκυτταρική αντίδραση MLR;

Answer 1

Είναι μία από τις βασικές in vitro μεθόδους αξιολόγησης της ιστοσυμβατότητας.
Βασίζεται στην επώαση, σε κοινή καλλιέργεια, των λεμφοκυττάρων από δύο
διαφορετικούς οργανισμούς, που συνήθως είναι ο δότης και ο δέκτης του μοσχεύματος

Question 2

Τι περιλαμβάνει ο ανοσολογικός προμεταμοσχευτικός έλεγχος του ζευγαριού δότη-δέκτη;

Answer 2

• προσδιορίζονται οι ομάδες αίματος σύμφωνα με το σύστημα ΑΒΟ,
• ταυτοποιούνται τα HLA-αντιγόνα και των δύο ατόμων (με μοριακές κυρίως
τεχνικές), και
• ανιχνεύονται αντι-HLA (κυτταροτοξικά) αντισώματα στον ορό του δέκτη.

Question 3

Που βοηθά η MLR;

Answer 3

Στη περίπτωση της μεταμόσχευσης οργάνων, η in vitro συγκαλλιέργεια των λεμφοκυττάρων
των δύο ατόμων μπορεί να προβλέψει και να προσδιορίσει την ανοσιακή απόκριση των Τ
λεμφοκυττάρων του δέκτη απέναντι στα αλλογενή HLA μόρια του δότη, την αντίδραση
δηλαδή του ξενιστή κατά του μοσχεύματος, αλλά και το αντίθετο, δηλαδή την αντίδραση
του μοσχεύματος κατά του ξενιστή, βοηθώντας ουσιαστικά στην επιλογή του
καταλληλότερου μοσχεύματος. Η ανοσιακή απόκριση των Τ λεμφοκυττάρων αξιολογείται
με κατάλληλες μεθόδους (μέτρηση του πολλαπλασιασμού), συνήθως με τη χρήση
επισημασμένων μορίων με ραδιενεργά στοιχεία

Question 4

Ποια η αρχή της μεθόδου MLR;

Answer 4

Η MLR βασίζεται στη μέτρηση και τον υπολογισμό της ικανότητας πολλαπλασιασμού
και κυτταροτοξικότητας των ειδικών Τ λεμφοκυττάρων του δέκτη (που ονομάζονται
λεμφοκύτταρα-απαντητές ή απαντητικά λεμφοκύτταρα, responders) μετά από διέγερσή
τους. Η διέγερση είναι αποτέλεσμα της αναγνώρισης αλλογενών επιφανειακών
αντιγόνων, δηλαδή των αλλογενών HLA μορίων, στα λεμφοκύτταρα και στα
αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (π.χ. μονοκύτταρα και δενδριτικά κύτταρα) του δότη
(που ονομάζονται κύτταρα-διεγέρτες ή διεγείροντα κύτταρα, stimulators)

Question 5

Τι συμβαίνει στη συγκαλλιέργεια;

Answer 5

Πιο συγκεκριμένα, όταν αλλογενή, δηλαδή διαφορετικού HLA απλοτύπου
ανθρώπινα λεμφοκύτταρα συγκαλλιεργηθούν, τα CD4+ Τ λεμφοκύτταρα του ενός δότη
αναγνωρίζουν τα ξένα HLA τάξης ΙΙ μόρια του άλλου δότη, ενεργοποιούνται και μέσα σε
24-48 ώρες αρχίζουν να πολλαπλασιάζονται. Κατά τις επόμενες 48 ώρες της MLR,
δημιουργείται και εκπτύσσεται και ένας πληθυσμός CD8+ Τ λεμφοκυττάρων, τα οποία
αναγνωρίζουν κυρίως διαφορές ως προς τα ξένα HLA τάξης Ι μόρια του δότη και
ενεργοποιούνται, διαφοροποιούμενα σε δραστικά κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα (CTLs).
(Η παραπάνω είναι αμφίδρομη MLR)

Question 6

Πώς μπορεί να μετρηθεί ο πολλαπλασιασμός των Τ λεμφοκυττάρων;

Answer 6

πολλαπλασιασμός των Τ λεμφοκυττάρων μπορεί να μετρηθεί προσθέτοντας
ραδιενεργό/τριτιωμένη θυμιδίνη (
3
Η-θυμιδίνη) στο θρεπτικό μέσο της καλλιέργειας. Η 3
Ηθυμιδίνη προσλαμβάνεται από τα πολλαπλασιαζόμενα λεμφοκύτταρα σε κάθε κυτταρική
διαίρεσή τους και ενσωματώνεται στο DNA τους. Συνολικά, μετά από περίπου 5-7 ημέρες
συγκαλλιέργειας, μπορεί με ασφάλεια να αξιολογηθεί η ιστοσυμβατότητα μεταξύ δύο
ατόμων.
Για
την αξιολόγηση του πολλαπλασιασμού, τα T λεμφοκύτταρα-απαντητές μαζί με τη
ραδιενέργεια που έχουν προσλάβει αναρροφώνται σε χάρτινο φίλτρο και η ακτινοβολία
που εκπέμπεται από το τρίτιο (
3
Η) προσδιορίζεται με ειδικό μετρητή β-ακτινοβολίας. Όσο
μεγαλύτερη είναι η διέγερση των λεμφοκυττάρων-απαντητών, και κατ΄ επέκταση ο πολλαπλασιασμός τους, τόσο υψηλότερες θα είναι και οι τιμές της ραδιενέργειας που λαμβάνονται από τον μετρητή.

Question 7

Ποιο το πρόβλημα σε αμφίδρομη MLR;

Answer 7

η διέγερση είναι αμφίδρομη, δηλαδή και τα Τ λεμφοκύτταρα
του ενός δότη ενεργοποιούνται από τα κύτταρα του άλλου δότη, αλλά και τα Τ
λεμφοκύτταρα του δεύτερου από τα κύτταρα του πρώτου. Συνεπώς, σε αμφίδρομη MLR
είναι ασαφές από την πρόσληψη της
3Η-θυμιδίνης πόσο έχει πολλαπλασιαστεί ο Τ
λεμφοκυτταρικός πληθυσμός του κάθε ατόμου ξεχωριστά.

Question 8

Τι συμβαίνει στη μονόδρομη MLR;

Answer 8

Σε αυτή τη δοκιμασία, ο
ένας κυτταρικός πληθυσμός, συγκεκριμένα τα κύτταρα-διεγέρτες, απενεργοποιούνται
πριν προστεθούν στα φρεάτια της MLR. Η απενεργοποίηση του κυτταρικού πληθυσμού
γίνεται είτε με ακτινοβόληση (περίπου με 2000-2500 rad), είτε μετά από κατεργασία με το
κυτταροστατικό φάρμακο μιτομυκίνη C (Εικόνα 13.2). Ως αποτέλεσμα, τα κύτταρα διεγέρτες χάνουν την ικανότητά τους να συνθέτουν DNA και να διαιρούνται, ενώ
διατηρούν την ανοσογονικότητά τους παρουσιάζοντας τα αλλοαντιγόνα τους στο
πληθυσμό των λεμφοκυττάρων-απαντητών.

Question 9

Πότε έχουμε υψηλή και πότε χαμηλή ιστοσυμβατότητα;

Answer 9

Όσο πιο έντονη είναι η διέγερση των Τ
λεμφοκυττάρων του δέκτη, τόσο περισσότερα αλλογενή HLA μόρια αναγνωρίζονται στα
κύτταρα-διεγέρτες (του δότη), και άρα τόσο πιο χαμηλή είναι η ιστοσυμβατότητα δέκτηδότη

Question 10

Ποιες ονομάζονται αυτόλογες αποκρίσεις;

Answer 10

Δείχνουν το μέτρο της κυτταρομεσολαβητικής
ανοσίας ενός ατόμου σε εαυτά αντιγόνα (αποτελεί ένδειξη υγιούς μηχανισμού
αυτοαναγνώρισης, ενώ η απουσία απόκρισης στην αυτόλογη MLR σχετίζεται με
κάποιες ασθένειες)

Question 11

Ποιες ονομάζονται αλλογενείς αποκρίσεις;

Answer 11

Προσδιορίζουν την ανοσιακή απόκριση ενός

ατόμου σε κύτταρα άλλου ατόμου του ίδιου είδους (π.χ. άνθρωπος με άνθρωπο

Question 12

Ποιες ονομάζονται ξενογενείς αποκρίσεις;

Answer 12

Ξενογενείς (xenogeneic) αποκρίσεις, που μετρούν την ανοσιακή απόκριση ενός ατόμου
ως προς τα κύτταρα άλλου ατόμου από διαφορετικό είδος (π.χ. άνθρωπος με χοίρο)

Question 13

Ποιες ονομάζονται μιτογενείς αποκρίσεις;

Answer 13

Είναι το μέτρο της κυτταρομεσολαβητικής
ανοσίας ενός ατόμου σε ένα συγκεκριμένο χημικό ή βιολογικό μόριο που ονομάζεται
μιτογόνο και επάγει τον λεμφοκυτταρικό πολλαπλασιασμό.

Question 14

Ποιος είναι ένας καλός θετικός μάρτυρας;

Answer 14

Ένας καλός θετικός μάρτυρας είναι η
χρησιμοποίηση ενός μιτογόνου (μιτογενής απόκριση), η οποία εξασφαλίζει ότι τα
λεμφοκύτταρα-απαντητές είναι ζωντανά και ικανά να αποκριθούν μετά από διέγερση

Question 15

Ποιος είναι ένας καλός αρνητικός μάρτυρας;

Answer 15

Ένας καλός αρνητικός μάρτυρας που ενδείκνυται να συμπεριλαμβάνεται στις μετρήσεις
είναι τα απενεργοποιημένα (με ακτινοβόληση ή με μιτομυκίνη C) κύτταρα-διεγέρτες. Σε
αυτά τα κύτταρα, ακόμα και μετά από διέγερση με τον μιτογόνο παράγοντα, δεν θα
πρέπει να παρατηρήσουμε πολλαπλασιασμό

Question 16

Τι είναι και πως υπολογίζεται ο δείκτης διέγερσης SI;

Answer 16

Η αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της MLR γίνεται με τον υπολογισμό του δείκτη
διέγερσης (stimulation index, SI) που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη σύγκριση του
πολλαπλασιασμού των Τ λεμφοκυττάρων που διεγέρθηκαν κάτω από διαφορετικές
συνθήκες, δηλαδή σε διαφορετικά πειράματα [ο SI υπολογίζεται διαιρώντας το μέσο όρο
των κρούσεων ανά λεπτό (cpm) των φρεατίων συγκαλλιέργειας λεμφοκυττάρωναπαντητών με κύτταρα-διεγέρτες με το μέσο όρο των cpm των φρεατίων που περιέχουν
μόνο λεμφοκύτταρα-απαντητές]
Χρησιμοποιώντας ως μέσο σύγκρισης τα SI, επαναλαμβανόμενες μετρήσεις με MLR μπορούν για παράδειγμα να υποδείξουν αν ένας
δέκτης οργάνου αρχίζει σταδιακά να ευαισθητοποιείται απέναντι στο μόσχευμα

Question 17

Ποιες είναι οι άλλες εφαρμογές της MLR;

Answer 17

Για τον έλεγχο και την αξιολόγηση της συνολικής ανοσιακής επάρκειας των Τ και των Β
λεμφοκυττάρων
Για την αξιολόγηση της ανοσιακής απόκρισης ενός ατόμου σε ειδικά αντιγόνα (π.χ.
τοξοειδές του τετάνου), όπου μειωμένος πολλαπλασιασμός των λεμφοκυττάρων είναι
ενδεικτικός γενικευμένης ή ειδικής ανοσοανεπάρκειας
• Για την πειραματική εκτίμηση της επαγωγής της παραγωγής κυτταροκινών και
χημειοκινών, που μπορούν να μετρηθούν στο υπερκείμενο των καλλιεργειών, της
ενδοκυτταρικής σηματοδότησης, αλλά και των απαιτήσεων των Τ και Β λεμφοκυττάρων
σε συγκεκριμένες συγκεντρώσεις αυξητικών κυρίως παραγόντων (π.χ. κυτταροκινών).

Question 18

Τι παρατηρείτε στα φρεάτια που προσθέσατε IL-2 σε σχέση με τα ίδια κύτταρα που δεν βάλατε IL-2;

Answer 18

Στα φρεάτια που προστέθηκε IL-2 τα λεμφοκύττρα του δέκτη που δεν έχουν υποστεί τη δράση του κυτταροστατικού παράγοντα μιτομυκίνη C (R1 δέκτη ή Α1) πολλαπλασιάζονται πολύ περισσότερο συγκριτικά με τα κύτταρα που δεν προστέθηκε IL-2. Αυτό είναι αναμενόμενο, καθώς η ιντερλευκίνη 2 αποτελεί μιτογόνο ουσία και εντείνει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Τα δείγματα αυτά συνιστούν τους θετικούς μάρτυρες, δηλαδή χρησιμοποιούνται ώστε να εξεταστεί αν τα κύτταρα του δέκτη είναι υγιή

Question 19

Στην περίπτωση του προμεταμοσχευτικού ελέγχου της ιστοσυμβατότητας δέκτη και δότη, τι τύπου MLR θα σχεδιάζατε και γιατί;

Answer 19

Μονόδρομη αλλογενής

Question 20

Θα μπορούσατε να αξιοποιήσετε τη μέθοδο της MLR για να μελετήσετε την
πιθανότητα ένας άνθρωπος να έχει ανοσοανεπάρκεια ; Αν ναι, πώς;

Answer 20

Η ανοσοανεπάρκεια ορίζεται ως η κατασταλμένη ή ελαττωμένη δυνατότητα κατάλληλης ανοσολογικής απάντησης σε αντιγονικά ερεθίσματα. Συγκεκριμένα για τον έλεγχο και την αξιολόγησης της συνολικής ανοσιακής επάρκειας των Τ και Β λεμφοκυττάρων θα μπορούσε να αξιοποιηθεί η μέθοδος της Μεικτής Λεμφοκυτταρικής Αντίδρασης. Η ανοσιακή επάρκεια ελέγχεται από την ικανότητα των λεμφοκυττάρων να αποκρίνονται σε πολυκλωνικά σήματα πολλαπλασιασμού, όπως η παρουσία μιτογόνων ή η ενεργοποίηση με αντισώματα των συνοδών μορίων των Β και Τ κυττάρων (αντι-CD3, αντι-CD2, αντι-CD20, αντι-CD28 κ.α.). Ανεπάρκειες στον πολλαπλασιασμό των λεμφοκυττάρων όπως ανιχνεύονται με την MLR, μπορεί να αποτελέσουν μία πρώτη ένδειξη για τη διάγνωση μίας γενικότερης ανοσοανεπάρκειας. Για μια τέτοια μελέτη αρκεί να σχεδιάσουμε μια MLR που βασίζεται σε μιτογενή απόκριση, όπου θα χρησιμοποιηθεί ένα χημικό ή βιολογικό μόριο, όπως για παράδειγμα οι ιντερλευκίνες 2 και 4 που επάγουν τον πολλαπλασιασμό των Τ και των Β λεμφοκυττάρων. Εκτός αυτού, ο μειωμένος πολλαπλασιασμός των Β και Τα λεμφοκυττάρων παρουσία ειδικών αντιγόνων (π.χ. τοξοειδές του τετάνου) που ανιχνεύεται με την MLR μέθοδο μπορεί επίσης να είναι ενδεικτικός γενικευμένης ή ειδικής ανοσοανεπάρκειας. Για τον σκοπό αυτό, μπορεί να σχεδιαστεί μια Μεικτή Λεμφοκυτταρική Αντίδραση για να διερευνηθεί η πολλαπλασιαστική ικανότητα των Β και Τ κυττάρων παρουσία ειδικού αντιγόνου όπως το τοξοειδές του τετάνου