6. Ανοσοηλεκτροφόρηση Flashcards
Τι ονομάζουμε ανοσοηλεκτροφόρηση;
Τεχνική διαχωρισμού και ταυτοποίησης πρωτεϊνικών συστατικών
ενός μείγματος που εκτελείται σε δύο στάδια. Στο πρώτο στάδιο πραγματοποιείται
ηλεκτροφόρηση του δείγματος, όπου οι πρωτεΐνες που εμπεριέχονται σε αυτό
διαχωρίζονται βάσει του φορτίου και της μοριακής τους μάζας μετά την εφαρμογή
ηλεκτρικού πεδίου στα άκρα του μέσου διαχωρισμού (δηλαδή του πηκτώματος). Το
δεύτερο στάδιο περιλαμβάνει την προσθήκη ειδικών αντισωμάτων έναντι συγκεκριμένων
πρωτεϊνών και ανοσοδιάχυση των αντιγόνων και των αντισωμάτων μέσα στο πήκτωμα για
το σχηματισμό ιζήματος
Ποια η διαφορά ανοσοηλεκτροφόρησης από Western blotting;
Δεν απαιτείται για το δεύτερο στάδιο η
απομάκρυνση/μεταφορά των πρωτεϊνών από το υλικό μέσα στο οποίο αρχικά
διαχωρίστηκαν (που συνήθως είναι πήκτωμα αγαρόζης). Αυτή είναι και η βασικότερη,
ίσως, διαφορά της ανοσοηλεκτροφόρησης από τις τεχνικές ανοσοστύπωσης κατά Western
(Western blotting), όπου μετά τον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό των πρωτεϊνών
απαιτείται ηλεκτρομεταφορά τους σε ειδική μεμβράνη νιτροκυτταρίνης για την έκθεση
και αναγνώρισή τους από τα κατάλληλα αντισώματα
Ποια η διαφορά ανοσοηλεκτροφόρησης από Western blotting;
Δεν απαιτείται για το δεύτερο στάδιο η
απομάκρυνση/μεταφορά των πρωτεϊνών από το υλικό μέσα στο οποίο αρχικά
διαχωρίστηκαν (που συνήθως είναι πήκτωμα αγαρόζης). Αυτή είναι και η βασικότερη,
ίσως, διαφορά της ανοσοηλεκτροφόρησης από τις τεχνικές ανοσοστύπωσης κατά Western
(Western blotting), όπου μετά τον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό των πρωτεϊνών
απαιτείται ηλεκτρομεταφορά τους σε ειδική μεμβράνη νιτροκυτταρίνης για την έκθεση
και αναγνώρισή τους από τα κατάλληλα αντισώματα
Ποια ονομάζεται περιοχή ισορροπίας ή ζώνη ισοδυναμίας;
Ο μηχανισμός σχηματισμού των συμπλεγμάτων αντιγόνου-αντισώματος είναι o ίδιος
με αυτόν της ανοσοδιάχυσης, δηλαδή το σύμπλεγμα σχηματίζεται και καθιζάνει ως ίζημα
στο πήκτωμα μετά από περίπου 18 ώρες, στην περιοχή όπου υπάρχει η κατάλληλη
αναλογία αντιγόνου και αντισώματος
Ποια η αρχή της μεθόδου της ανοσοηλεκτρόρησης;
Στην ανοσοηλεκτροφόρηση συνδυάζονται δύο ιδιότητες των πρωτεϊνών-αντιγόνων: (1)
η ικανότητά τους να κινούνται και να εστιάζονται σε συγκεκριμένη θέση σε στερεό μέσο
με βάση το φορτίο και τη μοριακή τους μάζα (ηλεκτροφόρηση), και (2) η ικανότητά τους
να καθιζάνουν σε στερεό μέσο δημιουργώντας ορατά ιζήματα, όταν συνδεθούν με ειδικό
αντίσωμα που αναγνωρίζει και προσδένεται σε αυτές (ανοσοδιάχυση-ανοσοκατακρήμνιση)
Η ανοσοηλεκτροφόρηση είναι ποιοτική ή ποσοτική μέθοδος;
Ποιοτική
Που μπορεί να συμβάλλει η ανοσοηλεκτροφόρηση σε ερευνητικό επίπεδο;
Σε ερευνητικό επίπεδο και εφόσον τα κατάλληλα ειδικά αντισώματα είναι
διαθέσιμα, η ανοσοηλεκτροφόρηση μπορεί να συμβάλλει στην:
• ανάλυση και προσδιορισμό της καθαρότητας πρωτεϊνών και ενζύμων,
• ανάλυση φαρμάκων,
• προσδιορισμό και ταυτοποίηση αντιγόνων σε ιστούς ζώων και φυτών, βιολογικά υγρά,
κυτταρικά εκχυλίσματα και σε μικροοργανισμούς, και
• προσδιορισμό και ταυτοποίηση αλλεργιογόνων σε τρόφιμα.
Τι είναι η ανοσοκαθήλωση;
Η ανοσοκαθήλωση (immunofixation) είναι μια ποιοτική μέθοδος
προσδιορισμού ενός αντιγόνου σε μίγμα πρωτεϊνών. Πρακτικά, είναι μια τροποποιημένη
ανοσοηλεκτροφόρηση, όπου μετά την ηλεκτροφόρηση του ορού επιστρώνεται ολόκληρη
η επιφάνεια του ηλεκτροφορητικού διαγράμματος με ειδικό αντιορό έναντι των ΙgG (αντιIgG) ή των IgA (αντι-IgA) ή των IgM (αντι-IgM), κλπ. Κατά την επώαση που ακολουθεί, το
αντίσωμα συνδέεται με το αντίστοιχο αντιγόνο πάνω στο πήκτωμα και καθιζάνει
σχηματίζοντας χαρακτηριστικές ζώνες (γραμμές καθίζησης) που βάφονται με κατάλληλες
χρωστικές
Ποια τα πλεονεκτήματα της ανοσοκαθήλωσης;
1) είναι μέθοδος πιο ευαίσθητη και με πιο σαφή εικόνα κατά την αξιολόγηση,
2) οι μονοκλωνικές δέσμες αναγνωρίζονται κατ’ αντιστοιχία προς τη θέση στην οποία
εντοπίζονται στην απλή ηλεκτροφόρηση του ίδιου δείγματος ορού,
3) μπορεί να εντοπίσει περισσότερες από μια μονοκλωνικές πρωτεΐνες στο ίδιο δείγμα,
4) διακρίνονται μονοκλωνικές πρωτεΐνες που έχουν παρόμοια ή ίδια ηλεκτροφορητική
κινητικότητα με άλλες πρωτεΐνες του ορού (στην ανοσοηλεκτροφόρηση αυτές
συνήθως καλύπτονται) και
5) είναι αποτελεσματικότερη στην ανίχνευση και χαρακτηρισμό των ελαφριών αλυσίδων
των ανοσοσφαιρινών.
Προς τα που γίνεται η μετακινηση πρωτεινων κατά την ηλεκτροφόρηση;
Η μετακίνηση των πρωτεϊνών κατά την ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης
γίνεται προς την άνοδο (+). Η ηλεκτροενδώσμωση προκαλεί τη μετακίνηση κάποιων
πρωτεϊνών προς την κάθοδο (-).
Ποια η διαφορά ανοσοηλεκτροφόρησης και ανοσοδιάχυσης;
Στην ανοσοηλεκτροφόρηση γίνεται ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών του ορού μετά από εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου σε πήκτωμα άγαρ, και δημιουργούνται πρότυπα καθίζησης ανάλογα με τον τύπο του αντιγόνου Στην ανοσοδιάχυση, δημιουργούνται και πάλι πρότυπα καθίζησης συμπλέγματος αντιγόνου-αντισώματος, ωστόσο στη περίπτωση αυτή μπορεί να γίνει και ποσοτικός προσδιορισμός των σχετικών συγκεντρώσεων του αντιγόνου ή του αντισώματος. Το ηλεκτρικό πεδίο δεν χρησιμοποιείται στην εκτέλεση της μεθόδου. Αυτό που αξίζει να σημειωθεί είναι ότι η ανοσοηλεκτρφόρηση παρέχει πολύ καλύτερη ανάλυση από την ανοσοδιάχυση σε πήκτωμα.
Ποιο από τα επόμενα δεν συμμετέχει στο σχηματισμό συμπλεγμάτων αντιγόνου – αντισώματος;
Α) υδροφοβικοί δεσμοί Β) ομοιοπολικοί δεσμοί Γ) ηλεκτροστατικές δυνάμεις Δ) δεσμοί υδρογόνου Ε) δυνάμεις van der Waals
Ομοιοπολικοί δεσμοί
Σας δίνεται μια μυελωματική πρωτεΐνη Χ, αγνώστου ισοτύπου και διάφορες άλλες μυελωματικές πρωτεΐνες γνωστών ισοτύπων (IgG, IgM, IgA).
α) πώς θα παράγετε αντι-ισοτυπικά αντισώματα που να μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ταυτοποίηση της άγνωστης πρωτεΐνης;
Α) Για την παραγωγή αντι–ισοτυπικών αντισωμάτων θα χορηγήσουμε ορό με την μυελωματική πρωτεΐνη Χ σε έναν διαφορετικό οργανισμό από αυτόν της προέλευσής του (π.χ. κουνέλι ή ποντίκι), και μετά από ένα χρονικό διάστημα σύμφωνα με το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε θα απομονώσουμε τον ορό του. Αυτός θα είναι πλέον αντι–ορός και θα περιέχει αντι-αντισώματα για την μυελωματική πρωτεΐνη Χ.
Σας δίνεται μια μυελωματική πρωτεΐνη Χ, αγνώστου ισοτύπου και διάφορες άλλες μυελωματικές πρωτεΐνες γνωστών ισοτύπων (IgG, IgM, IgA).
β) πώς μπορείτε να χρησιμοποιήσετε αυτά τα αντι-ισοτυπικά αντισώματα για να προσδιορίσετε τα επίπεδα της πρωτεΐνης Χ στον ορό ενός ζώου;
Για τον προσδιορισμό των επιπέδων της πρωτεΐνης Χ θα μπορούσε να αξιοποιηθεί η μέθοδος της ανοσοδιάχυσης και συγκεκριμένα η μονή ακτινωτή ανοσοδιάχυση (μέθοδος Mancini), ώστε να προσδιοριστεί και η σχετική συγκέντρωση της υπό μελέτη πρωτεΐνης. Στα φρεάτια του πηκτώματος τα αντι-ισοτυπικά αντισώματα προστίθενται σε σταθερή γνωστή ποσότητα, ενώ το αντιγόνο προστίθεται σε άγνωστη συγκέντρωση. Στη ζώνη ισοδυναμία η διάμετρος του δαχτυλίου σχετίζεται με την ποσότητα του αντιγόνου στο φρεάτιο. Για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης της μυελωματικής πρωτεΐνης Χ απαιτείται η κατασκευή πρότυπης καμπύλης. Διαφορετικά θα μπορούσε να αξιοποιηθεί η μέθοδος της ανοσοκαθήλωσης. Στην περίπτωση αυτή, μετά την ηλεκτροφόρηση του ορού, που περιέχει την μυελωματική πρωτεΐνη Χ, επιστρώνεται ολόκληρη η επιφάνεια του ηλεκτροφορητικού διαγράμματος με αντιορό έναντι των IgG, IgA, IgM και της πρωτεΐνης Χ. Ύστερα από τον σχηματισμό χαρακτηριστικών ζωνών, ανάλογα με τη μορφή τους, την ένταση της χρώσης, αλλά και την ηλεκτροφορητική κινητικότητα της γραμμής καθίζησης μπορούμε να προσδιορίσουμε την αντίστοιχη αναοσοσφαιρίνη, καθώς και αν αυτή είναι φυσιολογική ή όχι
