11. Κυτταρομετρία ροής Flashcards
Τι είναι τα CD μόρια;
Μόρια στην επιφάνεια των κυττάρων που ομαδοποιούν τα κύτταρα ανάλογα με τον τύπο, τη φάση ενεργοποίησης και το στάδιο διαφοροποίησής τους.
Ποια τα χαρακτηριστικά CD διάφορων κυττάρων;
τα Τ λεμφοκύτταρα χαρακτηρίζονται από την παρουσία του
CD3 μορίου, τα Β λεμφοκύτταρα από το CD19, τα μονοκύτταρα από το CD14, τα φυσικά
φονικά (ΝΚ) κύτταρα από τα CD16 και CD56, κ.λπ.
Πώς μπορούμε να διακρίνουμε κυτταρικούς πληθυσμούς;
Εάν τα μονοκλωνικά αντισώματα έναντι
CD μορίων έχουν σημανθεί με φθορίζουσες ουσίες (φθοριοχρώματα), τότε μπορούμε να
διακρίνουμε τους σημανθέντες κυτταρικούς υποπληθυσμούς είτε χρησιμοποιώντας
μικροσκόπιο φθορισμού είτε αναλύοντας τα δείγματα με κυτταρόμετρο ροής.
Τι είναι η κυτταρομετρία ροής;
Η κυτταρομετρία ροής αποτελεί ποσοτική, πολυπαραμετρική, αυτοματοποιημένη
μέθοδο ταυτοποίησης και μέτρησης των κυττάρων με βάση συγκεκριμένα φυσικοχημικά
και ανοσοφαινοτυπικά χαρακτηριστικά τους, όπως το μέγεθος και η εσωτερική τους
ομοιογένεια, και η έκφραση ή και παραγωγή συγκεκριμένων επιφανειακών ή
ενδοκυτταρικών μορίων, αντίστοιχα. Τα επιφανειακά ή ενδοκυτταρικά μόρια στοχεύονται
από μονοκλωνικά αντισώματα σημασμένα με φθοριοχρώματα και η πυκνότητα
επιφανειακής έκφρασης ή ενδοκυτταρικής παραγωγής των μορίων αυτών αντιστοιχεί στην
καταγραφόμενη ένταση φθορισμού
Τι καταγράφεται με το κυτταρόμετρο ροής;
Με τη χρήση του κυτταρομέτρου ροής εκτιμάται και καταγράφεται το μέτρο της
άμεσης αλληλεπίδρασης της φωτεινής δέσμης laser με τα κύτταρα, που ορίζεται ως
σκεδασμός. Συγχρόνως καταγράφεται και το αποτέλεσμα της επίδρασης του φωτός όταν
προσπίπτει σε φθορίζουσες ουσίες με τις οποίες έχουν σημανθεί ειδικά (συνήθως μέσω
μονοκλωνικών αντισωμάτων υψηλής συγγένειας) συγκεκριμένα εξωκυτταρικά ή και
ενδοκυτταρικά (κυτταροπλασματικά ή και πυρηνικά) κυτταρικά μόρια.
Τι ανιχνεύουν οι ευαίσθητοι φωτοανιχνευτές του κυτταρομέτρου;
(α) τον πρόσθιο ή ευθύγραμμο σκεδασμό του φωτός (forward scatter, FSC) από το κάθε
κύτταρο χωριστά, το μέτρο του οποίου μας δίνει πληροφορίες για το μέγεθος (όγκο)
του κυττάρου,
(β) τον πλάγιο σκεδασμό (side scatter, SSC), δηλαδή την κατά ορθή γωνία εξασθένιση του
φωτεινού σήματος, που μας δίνει πληροφορίες για το σχήμα και την
οπτική/εσωτερική ομοιογένεια του κυττάρου, και
(γ) τον φθορίζοντα πλάγιο σκεδασμό, που μας δίνει πληροφορίες για μορφολογικά
χαρακτηριστικά του κυττάρου (έκφραση επιφανειακών ή και παραγωγή
ενδοκυτταρικών μορίων) που σχετίζονται με την ένταση και τη χρονική διάρκεια του
σκεδαστικού σήματος
Πως κατανέμονται τα κύτταρα σε στικτόγραμμα μεγέθους FCS (οριζόντιος άξονας) και ομοιογένειας SSC (κάθετος άξονας);
Παρατηρούμε ένα σημαντικό ποσοστό κυττάρων με μικρό
μέγεθος και μεγάλη ομοιογένεια, που είναι τα λεμφοκύτταρα, έναν δεύτερο πληθυσμό
κυττάρων με μεγαλύτερο μέγεθος και σχετική ανομοιογένεια, που είναι τα μονοκύτταρα,
και έναν τρίτο πληθυσμό με ιδιαίτερα μικρό μέγεθος και σημαντική ομοιογένεια αριστερά
των λεμφοκυττάρων, που είναι τα νεκρά κύτταρα ή θραύσματα κυττάρων
Τι είναι τα ΝΚΤ κύτταρα;
Ταυτόχρονα CD3+ και CD56+. Πρόκειται για ένα ιδιαίτερο κυτταρικό τύπο, τα ΝΚΤ κύτταρα, τα οποία διαθέτουν μερικά από τα χαρακτηριστικά τόσο των Τ, όσο και των ΝΚ κυττάρων. Διαθέτουν Τ κυτταρικούς υποδοχείς (TCR) και αλληλεπιδρούν περισσότερο με CD1 μόρια, παρά με ΜΗC μόρια της τάξεως Ι και ΙΙ. Ταυτόχρονα, διαθέτουν την ικανότητα καταστροφής κυττάρων στόχων, εκκρίνοντας μεγάλες ποσότητες κυτταροκινών που απαιτούνται για την υποστήριξη της παραγωγής αντισωμάτων από τα Β κύτταρα, την ανάπτυξη φλεγμονής και τη δημιουργία και τον πολλαπλασιασμό των κυτταροτοξικών Τ κυττάρων
Ποια κύτταρα έχουν ταυτόχρονα CD8 και CD4;
Πρόκειται για ανώριμα Τ λεμφοκύτταρα που δεν έχουν διαφοροποιηθεί σε βοηθητικό ή κυτταροτοξικό πληθυσμό.
Ποια είναι τα πλεονεκτήματα της χρησιμοποίησης της κυτταρομετρίας ροής για διαγνωστικούς σκοπούς στην κλινική πρακτική;
Αναλυτική ικανότητα, αξιοπιστία, ταχύτητα, ανάλυση μεγάλου αριθμού κυττάρων σε μικρό χρονικό διάστημα, ανίχνευση κυττάρων με πολύ χαμηλή συχνότητα
Ποια τα μειονεκτήματα της χρησιμοποίησης της κυτταρομετρίας ροής για διαγνωστικούς σκοπούς στην κλινική πρακτική;
Απώλεια της ιστολογικής δομής από την οποία προέρχονται τα κύτταρα, ακριβά μηχανήματα, εξειδικευμένες γνώσεις ανάλυσης δεδομένων
Χρησιμοποιώντας το στικτόγραμμα μεγέθους (FCS) και εσωτερικής ομοιογένειας (SSC) όπως παρουσιάζεται στο Σχήμα 15.6, μπορείτε να οριοθετήσετε χωριστά τους λεμφοκυτταρικούς υποπληθυσμούς των βοηθητικών Τ λεμφοκυττάρων και των ΝΚ λεμφοκυττάρων; Εξηγείστε γιατί.
Παρατηρώντας το στικτόγραμμα μεγέθους (FCS) και εσωτερικής ομοιογένειας (SSC) δεν μπορούμε να οριοθετήσουμε χωριστά τους λεμφοκυτταρικούς υποπληθυσμούς των βοηθητικών Τ λεμφοκυττάρων και των ΝΚ λεμφοκυττάρων. Αυτό που μπορεί να οριοθετηθεί είναι δύο πύλες, η R1 και η R2, οι οποίες περικλείουν τα λεμφοκύτταρα και τα μονοκύτταρα αντίστοιχα. Στην πύλη R1 οριοθετούνται συνολικά τα Τ, Β και ΝΚ λεμφοκύτταρα, τα οποία παρουσιάζουν μικρό μέγεθος και μεγάλη ομοιογένεια. Από την εικόνα του στικτογράμματος δεν μπορούμε να ξεχωρίσουμε, λοιπόν, βοηθητικά Τ και ΝΚ λεμφοκύτταρα. Αυτός μπορεί να γίνει απεικονίζοντας σε στικτογράμματα την ένταση του φθορισμού των μονοκλωνικών αντισωμάτων με φθοριόχρωμα και αναλύοντας τα αποτελέσματα.
Έχετε στη διάθεσή σας ένα κυτταρόμετρο ροής παλιάς τεχνολογίας, με τη δυνατότητα να ανιχνεύει την ένταση φθορισμού για 3 μόνο διαφορετικά φθοριοχρώματα σε κάθε δείγμα. Πώς θα μπορούσατε να αναλύσετε ένα δείγμα μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος ανθρώπου; Αναφέρατε πιθανούς συνδυασμούς φθοριοχρωμάτων που θα χρησιμοποιούσατε και τις παραμέτρους που θα ανιχνεύατε σε κάθε δείγμα
Θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν φθοριοχρώματα για τα αντισώματα έναντι των CD μορίων 3,56 και 19. Με αυτόν τον τρόπο θα ξεχώριζαν τα Τ λεμφοκύτταρα (CD3+,CD56-,CD19-) -όχι όμως οι υποπληθυσμοί τους-, τα ΝΚ κύτταρα (CD56+, CD3-, CD19-) και τα Β λεμφοκύτταρα (CD3-,CD56-, CD19+).
Σε περίπτωση που επιθυμούσαμε να ανιχνεύσουμε μονοκύτταρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν φθοριοχρώματα για τα αντισώματα έναντι των CD μορίων 3,14 και 19. Με αυτόν τον τρόπο θα ξεχώριζαν τα Τ λεμφοκύτταρα (CD3+,CD14-,CD19-) -όχι όμως οι υποπληθυσμοί τους-, τα μονοκύτταρα (CD14+, CD3-, CD19-) και τα Β λεμφοκύτταρα (CD3-,CD14-, CD19+).
