كشت بافت

Question 1

پي اچ مناسب براي كشت اينويترو :

Answer 1

به نظر ميرسد ٥ تا ٦٠٥ براي رشد مناسب باشد. زيرا pH كمتر (كمتر از ٤.٥) و pH بالا (بالاتر از ٧) عموما در كشت اينويترو باعث توقف رشد و نمو مي شود.

Question 2

اگر pH خيلي پايين باشد چه مسائلي بوجود مي آيد:

Answer 2

١-اكسين IAA و اسيدجيبرليك ، كمتر پايدار مي مانند.
٢-غلظت آگار ، كم(آبكي) ميشود(لازم است محيط كشت تازه با pH مطلوب آماده شود.
٣-احتمال رسوب نمكهاي خاص(نمكهاي فسفات و آهن) وجود دارد.
٤-ويتامين B1 و اسيد پانتوتنيك ،كمتر پايدار مي مانند.
٥- جذب يونهاي آمونيوم كند مي شود.

Question 3

پي اچ قبل و بعد از اتوكليو متفاوت است؟؟

Answer 3

اگر pH اوليه بين ٥ تا ٧ باشد معمولا ٠/٣ تا ٠/٥ واحد پايين مي آيد. PH اوليه برابر ٦ در حين رشد ميتواند تا ٥/٥ يا كمتر از آن برسد.

Question 4

اگر در حين تهيه محيط كشت pH خيلي پايين يا خيلي بالا باشد ميتوان به ترتيب آن را با … يا … تنظيم كرد .

Answer 4

NaOH
HCL
(١تا٠.١ مولار)

Question 5

تشخيص ويروس :

Answer 5

تشخيص گياهان(عاري از ويروسهاي شناخته شده) به صورت مشاهده اي امكان پذير نيست؛ زيرا آلودگي هاي ويروسي پنهان زيادي مي باشند. بنابراين بايد به صورت زير عمل كرد:
١- گياهان آزمون : شيره پرورده گياهي كه براي آزمايش موردنظر است، بر روي برگ گياه آزمون كه قبلا به وسيله پودر كربوراندوم تيمار شده است مايه كوبي ميشود. اگر در شيره پرورده ويروس وجود داشته باشد پس از چند روز گياه آزمون شروع به نشان دادن علائم ويروسي ميكند.
٢- ميكروسكوپ الكتروني: به دليل گران بودن كمتر استفاده ميشود.
٣- سرولوژي : اگر يك خرگوش بوسيله يك گيرنده پروتئيني مثل يك ويروس گياهي تزريق شود ، در اين صورت آنتي بادي مخصوص تشكيل ميشود. اگر يك قطره از شيره ي پرورده ي سانتريفيوژ شده گياهي به آنتي سرم خون خرگوش اضافه شود، در صورت وجود ويروس ، رسوب تشكيل مي شود. يكي از اين روش ها ، روش ELISA

Question 6

عوامل تعيين كننده احتمال موتاسيون و فراواني وقوع آن در اينويترو:

Answer 6

١- روش تكثير رويشي مورد استفاده
٢-شيمر بودن گياه مورد نظر 
٣-نوع مواد تنظيم كننده رشد مورد نظر 
٤- نوع بافت استفاده شده
٥-مواد اوليه
٦-تعداد دفعات واكشت

Question 7

هدف از ازدياد گياهان؛

Answer 7

هدف از ازدياد گياهان ، حفظ و افزودن گياهان داراي ويژگي هاي ارزشمند و استفاده بهينه از خصوصيات آنها مي باشد.

Question 8

كشت بافت تكنيكي براي حل مشكل … است .

Answer 8

گياهان به دو روش جنسي و غيرجنسي تكثير ميشوند، گاهي روند تكثير به دلايلي متوقف يا كند تر از نياز ميشود و يا گياه دچار آلودگي شديد ميگردد ، كه اين شرايط در نهايت آن را از چرخه محيط زيست حذف ميكند. كشت بافت تكنيكي جهت حل اين مشكل مي باشد.

Question 9

كشت بافت ؟

Answer 9

به عملياتي نظير كشت سلول ها، بافت ها و اندام هاي استريل و اجزاي آنها تحت شرايط مطلوب فيزيكي و شيميايي در آزمايشگاه كشت بافت اطلاق ميشود.

Question 10

تكنيك هاي كشت بافت: (انواع كشت بافت)

Answer 10

١- كشت كالوس 
٢- كشت سلول 
٣- كشت اندام
٤- كشت مريستم 
٥- كشت پروتوپلاست

Question 11

كشت كالوس

Answer 11

كشت دانه رست ها (نشاها) يا قطعات جدا كشت گياهان بر روي محيطهاي حاوي آگار و هورمون كه منجربه توليد توده سلولي ميگردد

Question 12

نيازهاي اوليه جهت كشت بافت :

Answer 12

١- ماده گياهي زنده
٢- آزمايشگاه مجهز تا حد نياز
٣-كارور اگاه به تكنيك هاي كشت بافت
٤- گلخانه قرنتينه اي

Question 13

به طور خلاصه مراحل اصلي كشت بافت عبارتند از :

Answer 13

١- انتخاب گياه مناسب 
٢- ايجاد كشت عاري از بيماري
٣ تكثير 
٤-رشد طولي
٥-تشكيل ريشه
٦- كشت در محيط خارج

Question 14

كشت سلول:

Answer 14

كشت سلولها در محيطهاي مايع (بدون آگار) در ظرفهايي كه معمولا با تكان دادن تهويه ميشوند.

Question 15

كشت اندام:

Answer 15

كشت جنين ها،بساك ها ، تخمدان ها ، ريشه ها، نوساقه ها يا اندامهاي گياهان بر روي محيطهاي مغذي

Question 16

كشت مريستم و ريخت زايي يا مرفوژنز

Answer 16

كشت مريستم هاي نوساقه ها يا قطعات جدا كشت ديگر گياهان بر روي محيط مغذي به منظور توليد گياهان كامل

Question 17

كشت پروتوپلاست

Answer 17

جداسازي پروتوپلاستهاي گياهان و كشت دادن آنها بر روي محيطهاي مناسب

Question 18

مهمترين كاربرد و مزاياي كشت بافت :

Answer 18

مهمترين ماربرد تجاري كشت بافت گياهي توليد ميليون ها گياه جديد و يكسان با كيفيت خوب و در زمان كوتاه از يك پايه مي باشد.

Question 19

كاربرد و مزاياي كشت بافت :

Answer 19

رشد در مقياس بزرگ از سلول هاي گياهي در كشت مايع به عنوان يك منبع از محصولات ثانويه.

• تلاقي بين گونه اي با فاصله ژنتيكي دور توسط پروتوپلاست فيوژن و بازسازي هيبريد.
• توليد گياهان هاپلوئيد از كشت هاپلوئيد براي رسيدن به خطوط هموزيگوت با سرعت بيشتري در برنامه هاي اصلاحي
• حذف ويروس با استفاده از كشت مريستم
• تسهيل و امكان جوانه زني بذوري كه كه در خارج از آزمايشگاه امكان جوانه زني آنها وجود ندارد.
• توليد پايه و گياه در تمام فصول
• صرفه جويي در منابع سوخت فضاي گلخانه
• استخراج مواد شيميايي ،دارويي و اسانس هاي مختلف
• استفاده از كشت بافت به عنوان بيوراكتور زيستي
• توليد شيمر.

Question 20

شيمرها

Answer 20

بعضي گياهان مستعد جهش هاي ژنتيكي موضعي يا شيمرها (مثل قطعات رنگي روي برگ ها يا اشكال مختلف برگ در روي شاخه) مي باشند. چنين صفات ژنتيكي در كشت بافت ايجاد خواهند شد. با اين حال بعضي از صفات شيمرها ممكن است كه بطور اختصاصي بعنوان يك خصوصيت مطلوب و مورد علاقه انتخاب شوند.

Question 21

محل مناسب آزمايشگاه و نكات مهم :

Answer 21

محل مناسب بسيار مهم است، نبايد در مجاورت آزهايي كه از ميكروارگانيسم ها و يا حشرات استفاده ميكنند يا محل ذخيره بذور و مواد گياهي هستند باشد، زيرا آلودگي از طريق دريچه هوا و رفت و آمد زياد مسئله ساز مي شود.
رفت و آمد زياد موجب بالا رفتن غبار از كف زمين شده و به گسترش آلودگي كمك ميكند. از قرار دادن گلدان حاوي گياه اجتناب شود زيرا ميتواند منبعي از كنه ها و ساير موجودات آلودع كننده ديگر باشد. بلافاصله بعد از پايان كار در مزرعه يا گلخانه نبايد وارد آز شد زيرا احتمال ورود كنه و حشرات و دانه هاي گرده و قارچهاي چسبيده به مو و يا لباس به داخل آز وجود دارد.

Question 22

براي انجام كشت بافت هاي گياهي و كشت ميكروارگانيسم ها در شرايط كنترل شده و استريل اولين نياز وجود … است.

Answer 22

آزمايشگاه مجهز به امكانات ضروري است .

Question 23

يك آز مناسب براي انجام فعاليت آزمايشي بايد :

Answer 23

مجهز به تمامي ابزارهاي ضروري و توانايي حفظ شرايط استريل در تمام مراحل انجام كار باشد كه علاوه بر موفقيت در انجام آز ،ضامن حفظ سلامت آزمايشگر و محيط زيست نيز باشد.

Question 24

هود لامينار؛ نام هاي ديگر آن: دليل استفاده از آن و طرز كار:

Answer 24

دستگاه لامينار ايرفلو يا هود استريل: مولد هواي استريل مي باشد . هنگام كشت گياه را زير هود استريل كشت ميدهيم زيرا هوا داراي انواع مختلف عوامل بيماريزا به خصوص اسپور قارچهاي مختلف است. اتاقك استريل محلي است كه هواي مكيده شده از خارج قبل از ورود به آن با عبور از فيلترهاي بسيار ريز تصفيه مي شود . اين سيستم تصفيه محفظه اي حاوي هواي استريل ايجاد مينمايد. در غير اين صورت ميزان آلودگي افزايش چشمگيري مي يابد.

Question 25

Growth chamber

Answer 25

اين اتاقك ها از لامپهاي آفتابي و مهتابي استفاده شده و دماي آن قابل تنظيم مي باشد و بسته به نوع گياه در محدوده ٢٥ درجه سانتيگراد ثابت نگاه داشته ميشود. با استفاده از تايمر مي توان فتوپريد مناسب را براي هر گياه ايجاد نمود.

Question 26

اتوكليو:

Answer 26

دستگاهي براي استريل كردن محيط هاي كشت و وسايل شيشه اي استفاده مي شود. براي اينكار محيط كشت و وسايل مورد نياز كه بايد استريل شوند درون محفظه اين دستگاه قرار داده ميشوند و سپس به مدت ٢٠ دقيقه در معرض بخار آب با دماي ١٢٠ درجه سانتيگراد قرار ميگيرند كه باعث از بين رفتن عوامل بيماريزا تا ميزان ٩٩.٩٩٩ ٪‏ مي شود.

Question 27

ابزار مهم مورد نياز كشت:

Answer 27

هود لامينار- اتوكليو- دستگاه آب مقطر گيري- لوازم شيشه اي-اتاقك رشد-ترازوي حساس-pH متر- اون-
مواد و ابزار لازم براي استريل كردن جداكشت، محيطهاي كشت- الكل- و ابزار براي برش و ريز كردن اندام گياهي ترجيحا تيغ جراحي و پنس و چراغ الكلي و …

Question 28

شرايط نگهداري مواد شيميايي :

Answer 28

فهرستي از تمام مواد موجود در آزمايشگاه بايد تهيه گردد. بايستي به نوع مواد،شرايط نوري و دمايي نگهداري ،سميت و تاريخ انقضاء دقت شود. مواد شيميايي فرار سمي مانند فنول بايد زير هود مخصوص و مواد حساس به رطوبت در ظرفي مانند ديسكاتوز نگهداري شوند. حدالمقدور تلاش شود دماي آزمايشگاه بين ٢١ تا ٢٥ درجه سانتيگراد ثابت بماند.

Question 29

انواع روشهاي استريل كردن:

Answer 29

١- استفاده از حرارت و فشار بخار آب(اتوكليو) : محيطهاي غذايي كشت بافت و باكتريايي و ساير ابزار مقاوم با اين روش استريل ميشوند. ، محيط كشت را به مدت ٢٠دقيقه در معرض دماي ١٢٠ درجه سانتيگراد و تحت فشار ١٥ پاسگال پوند بر اينچ مربع قرار ميدهند.*استفاده از گرما براي استريليزاسيون اثرات تجزيه كنندگي اجزا و يا احتمال وقوع واكنش شيميايي بين اجزاي محيط كشت را دارد بايد حتما توجه كرد كه افزايش مدت زمان استريل باعث تجزيه اجزا قندي محيط كشت و تبديل به مواد سمي ،رسوب برخي تركيبات يوني و تجزيه آگار مي شود.
٢-استفاده از حرارت خشك: ابزارهاي فلزي،شيشه آلات(يا وسايل خشك) با اين روش استريل ميشوند. اين وسايل در دماي ١٦٠-١٨٠ درجه سانتيگراد به مدت ٢ساعت استريل مينمايند. (فويل آلومينيومي براي استريل ماندن تا زمان كشت)
٣-استفاده از فيلتر: برهي از اجزاي محيط كشا ex: اسيدهاي آمينه ،تنظيم كننده هاي رشد به شدت نسب به حرارت حساس هستند و در اثر حرارت تجزيه ميشوند بنابراين نميتوان از اون يا اتوكليو براي استريل كردن آنها استفاده نمود. بايد از فيلترها با اندازه منافذ قابل انتخاب معمولا ٠.٢ تا٠.٤ ميكرومتر براي اين كار استفاده ميشود. در اين روش تمام ميكروارگانيسمها و ويروسها به علت اندازه بزرگتر از قطر منافذ فيلتر قادر به عبور از فيلتر نميباشند و نمونه عاري از عوامل ميكروبي تهيه ميشود.
٤-ساير استريل كننده ها: نور UV,مواد ضدعفوني كننده (الكل و HgCl2) و شعله نيز از ساير استريل كننده ها مي باشند. كه بسته به شرايط مورد استفاده قرار ميگيرند.

Question 30

اولين نياز جهت انجام كشت بافت ريز نمونه گياهي شرايط آزمايشگاهي اينويترو … است.

Answer 30

يك بستر مناسب براي رشد و نگهداري نمونه است.

Question 31

مشخصات محيط كشت:

Answer 31

بستري براي رشد كه بايد تمامي نيازهاي معدني(عناصر كم مصرف و پرمصرف) ، منبع تامين انرژي (كربوهيدرات)، مكمل ها،تنظيم كننده هاي رشد و آب مورد نياز گياه را تامين كند،اين نيز بسته به نوع نمونه (بذر،برگ و…) متغير است. به اين بستر اصطلاحا محيط كشت ميگويند. در تهيه محيط كشت بايستي به مجموعه اي از تركيبات نمكهاي معدني،منبع كربني ،ويتامين ها ، هورمونها ،مواد آلي ،pH محيط كشت و… توجه داشت.

Question 32

انواع محيط كشت:

Answer 32

جامد و مايع. هنگام استفاده از بذر ،بافتهاي سخت و نيمه سخت و يا بافت هايي كه به اندازه كافي در اختيار ميباشند استفاده از محيط كشت جامد ترجيح داده مي شود. محطيط كشت هاي مايع جهت كشت سلولي به صورت معلق مورد استفاده قرار ميگيرند.

Question 33

چند محيط كشت وجود دارد؛ معروفترين آنها؟ تفاوت اصلي آنها؟

Answer 33

بيش از پنج هزار محيط كشت ساخته شده است كه مهمترين آنها عبارتند از: MS, B5, DKW, wPM
همه اين محيط كشت ها تمامي نياز غذايي مورد نياز گياه را تامين ميكنند و تفاوت بين آنها متفاوت بودن غلطت تركيبات موجود است.

Question 34

ميزان ساكروز و آگار مورد نياز براي محيط كشت MS :

Answer 34

ساكروز :٣٠gr

آگار: ٨gr

Question 35

نحوه استفاده ويتامينها در محيط كشت:

Answer 35

اكثر ويتامين ها توسط گياه ساخته ميشود اما اضافه كردن بعضي ويتامين ها مثل B3 ,B1, B6 ضروري است. همچنين ويتامين C به عنوان آنتي اكسيدان. معمولا به صورت استوك تهيه ميشوند. براي استريل كردن از فيلتر استفاده ميشود.

Question 36

نقش هورمونها در محيط كشت:

Answer 36

در ايجاد تمايز و شكل گيري اندام ها موثر هستند. اكسين جيبرلين سيتوكنين.گاهي ABA.. سيتوكنين از مهمترين هورمونها در تمايز بافتها مي باشد. جيبرلين محدود به كشت جنين است. چون جيبرلين از اندام زايي ارگانوژنز جلوگيري ميكند. اكسينها در توليد كالوسها كاربرد بيشتري دارند..

Question 37

جهت توليد كالوس از بذر(جنين) به شرح زير عمل ميكنيم:

Answer 37

بذرها را در صورتي كه پوشش و يا غلاف داشته باشند دستي پوست زدايي كرده و با استفاده از آب معمولي شهري خاك زدايي كرده و گاهي اوقات از شوينده هاي معمولي نظير صابون هاي مايع نيز ميتوان استفاده كرد.
١- بذرها را به مدت ٣٠ تا ١٨٠ ثانيه در محلول HgCl2 ,با غلظت ٠.٠١ درصد بسته به مقاومت و نوع پوشش بذر ضدعفوني و سپس سه مرتبه با آب مقطر استريل شستشو و آبكشي مي نمائيم.
٣- بذرهارا به مدت ٣٠تا ١٨٠ ثانيه در محلول هيپركلريذ ١-٥ درصد ضدعفوني و سه مرتبه به كمك آب مقطر استريل شستشو و آبكشي مي نماييم و سپس به مدت ٣٠ تا ٦٠ ثانيه در الكل ٧٠ درصد ضدعفوني و سه مرتبه به كمك آب مقطر استريل شستشو و آبكشي مينماييم.
همه اين مراحل در زير هود لامينار انجام ميدهيم.. تا موقع كاشت زير هود روشن باشند. بعد از كشت تا دوهفته در محيط تاريك باشند. با دماي ٢٥ درجه سانتيگراد.

Question 38

بعد از گذشت … از كشت بذر از محل رشد ساقه توليد كالوس شروع ميگردد.

Answer 38

دو هفته

Question 39

جهت رشد بيشتر كالوسها چه كاري لازم است انجام شود :

Answer 39

آنهارا از باقيمانده بذر و اندام هاي هوايي جدا نموده و در محيط كشت مشابه بازكشت ميكنيم.

Question 40

برگ كدام گياهان بيشتر براي كشت بافت مورد استفاده قرار ميگيرد؛ نكته مهم و قابل توجه در كشت برگ:

Answer 40

سرعت عمل يكي از عوامل موفقيت است زيرا برگ يكي از بخش هاي حساس گياه بوده كه در مواجه شدن با استرس هاي محيطي در مدت زمان كوتاهي تخريب و غيرقابل استفاده خواهد شد.
برگ در گياهان دو لپه كاربرد فراواني در باززايي و توليد كالوي دارد..

Question 41

نكات مهم براي كاشت برگ:

Answer 41

قبل از چيدن برگ محيط كشت آماده و در يخچال يا هود نگهداري شود..نمونه از گياه سالم و مناسب گرفته شود.گياه مورد استفاده فاقد هرگونه زخم ترك گال و يا حالت دفورمه در تمام اندام هاي خود باشد.از جوانترين بخش گياه . اگه گياه گلداني بود ، گلدان به آزمايشگاه منتقل شده و نمونه گرفته شود، اگه گياه مورد نظر درخت باشد بايد نمونه بصورت شاخه اي تهيه شود و در پلاستيك حمل شود . اگه زمان رسيدن بيشتر از پنج ساعت باشد و دما بيش از ١٥ دجه بهتر است شاخه در ظرف آب استريل قرار داده شود.

Question 42

باز زايي

Answer 42

فرايند تبديل ريزنمونه هاو كالوسهاي توليدي به گياه كامل را باززايي ميگويند..

Question 43

باز زايي مستقيم برگ:

Answer 43

در اين روش محيط كشت را به گونه اي طراحي مينماييم كه گياهچه جديد را بطور مستقيم از ريز نمونه حاوي سيتوكنين كشت ميدهيم و بعد توليد ساقه و برگ و براي تحريك ريشه زايي در نمونه هايي كه به خوبي شاخه زايي كرده اند آنهارا به محيطهاي غني از اكسين ميبريم.

Question 44

باز زايي غير مستقيم :

Answer 44

در اين نوع باز زايي محيط كشت را به گونه اي طراحي مينماييم كه گياهچه جديد را بطور غيرمستقيم از ريزنمونه تهيه كنيم ، براي اينكار همانند شكل در ابتدا ريزنمونه را در محيط كشت حاوي غلظت هاي مختلف 24D براي توليد كالوس قرار ميدهيم و سپس كالوس را در محيط كشت ms حاوي سيتوكنين كشت ميدهيم و بعد از توليد ساقه و برگ به محيط كشت بدون هورمون براي توليد ريشه انتقال ميدهيم ، در پايان اين مرحله گياهچه هاي كه هم ساقه و برگ و هم ريشه دارند توليد مي شوند.

Question 45

انتقال گياهچه هاي حاصل از كشت بافت به گلدان ها:

Answer 45

پس از توليد ريشه گياهچه جديد را به آرامي از داخل لوله يا ظرف باز زايي جدا نموده و تمامي محيط كشت دور ريشه آن را توسط آب شسته و سپس آن را به خاك كاملا سبك و استريل انتقال ميدهيم . اين گياهچه بايد به مدت يك هفته در رطوبت بالاي ٥٠٪‏ و در گلخانه نگهداري شود.

Question 46

هورمون كلوس زايي

Answer 46

24D

Question 47

هورمون باز زايي مستقيم:

Answer 47

BAP

Question 48

Hardening

Answer 48

عمل مقاوم سازي گياهچه حاصل از كشت بافت به شرايط بيرون از شيشه (اينويترو) گفته ميشود.