Wardit Tigchelaar Primers Flashcards
Wat zijn eisen voor primers? (4)
- Primers worden altijd opgeschreven in de 5’ 3’ richting.
- De primers zijn maximaal tussen 18-30bp, optimaal is 22-25bp:
- De optimale productgrootte tussen de 80-200bp.
- Primers moeten dezelfde smelttemperatuur Tm hebben, optimaal 62*C.
Hoe bepaal je de annealing temperatuur?
De annealing temperatuur 3-5*C ligt lager dan de Tm. De Tm bepaalt dus de annealing temperatuur.
- Te hoog = primers kunnen niet binden.
- Te laag = niet specifieke binding.
Op welke 4 locaties/manieren kun je primers ontwerpen?
Primers ontwerpen binnen hetzelfde exon.
Primers ontwerpen over een exon junction.
Primers ontwerpen over een groot intron.
Primers ontwerpen over een klein intron.
Wat voor product krijg je als je Primers ontwerpen binnen hetzelfde exon? Wat zijn voor en nadelen?
Productgrootte is hetzelfde voor gDNA en cDNA.
- Voordeel = de primers kunnen zowel gDNA als cDNA detecteren.
- Nadeel = je kan in de qPCR geen gDNA contaminatie zien.
Wat voor product krijg je als je Primers ontwerpen over een exon junction.? Wat zijn voor en nadelen?
Geen product van het gDNA mogelijk.
- Voordeel = je amplificeert alleen het cDNA.
- Nadeel = er is niet altijd een (groot) intron aanwezig.
Wat voor product krijg je als je Primers ontwerpen over een groot intron? Wat zijn voor en nadelen?
Geen product als je gDNA amplificeert. Wel product als je cDNA amplificeert.
- Voordeel = je amplificeert alleen het cDNA
- Nadeel = er is niet altijd een groot intron aanwezig.
Wat voor product krijg je als je Primers ontwerpen over een klein intron? Wat zijn voor en nadelen?
Product van het gDNA is groter dan van cDNA.
- Voordeel = je kan gDNA contaminatie zien.
- Nadeel = een klein genoeg intron is niet altijd aanwezig
Nadeel = interfeert met je resultaat.
Waar moet je primers op controleren?
Controleren op self annealing en primer dimers.
Controleer op de GC clamp en nucleotide repeats.
Controleer op de specifiteit.
Hoe controleer je op self annealing en primer dimers?
Kies primers die een lage self-complemantarity score hebben.
Kies primers die een lage 3’-complementarity score hebben.
= 3’-complementarity is de waarschijnlijkheid dat de primer aan zichzelf en aan het 3’-uiteinde van de complementaire primer zal binden.
Wat is GC clamp en waarom wil je dit?
GC clamp betekent dat er één G of een C base in de laatste 5 basen van de primer zit.
- Waarom = G en C vormen sterkere waterstofbruggen en verhoogt de specifiteit
Waarom controleer je op nucleotide repeats?
Meer dan 3 nucleotide repeats verminderd de specifiteit.
Wat wordt bedoeld met controleren op specifiteit?
Kies primers die specifiek zijn voor het bedoelde gen.
