Rick Orij DNA sequencing Flashcards
Wat is de definitie van het genoom?
De complete genetische samenstelling van een organisme, cel of virus.
Wat is de definitie van het transcriptoom?
Geheel aan RNA moleculen
Wat zijn de stappen van Sanger Sequencing?
DNA template + Primer –> DNA polymerase verlengt sequentie. –> Verlening stopt door het verwijderen van een zuurstofatoom. –> Fluorescentie wordt gemeten. –> Met behulp van een fluorescentie kun je aantonen bij welke base de verlenging gestopt is.
Waarom is de maximale lengte van een Sanger read ~100bp? (2)
- Grotere fragmenten zijn op een polyacrylamide gel niet goed te scheiden.
- De sterkte van het fluorescente signaal neemt af vanwege het afnemende aantal moleculen van langere lengte.
Wat is het verschil tussen Sanger en NGS?
Bij Sanger doe je maar een fragment tegelijk per reactie. Bij NGS een groot complex mengsel van random fragmenten per reactie.
Hoe kun je bij NGS een groot complex mengsel van random fragmenten per reactie meten? 2 trucs.
- Het scheiden van DNA fragmenten door verankering.
2. Real time sequencing.
Wat is Real-time sequencing?
Basen worden geïdentificeerd op het moment dat ze worden ingebouwd door de polymerase.
Op welke 2 manieren kun je DNA fragmenten scheiden?
- Clonaal amplificeren.
2. Emulsie PCR.
Wat gebeurt er met het originele template in clonal bridge amplification?
Het wordt na de eerste amplificatie weggewassen.
Waar vindt emulsie PCR plaats?
vindt plaats in olie, daar zitten waterdruppels in met elk een bolletje en een dubbelstrengs DNA-fragment .
Welke twee methodes zijn er om te real-time sequencing?
- Illumina.
2. Ion Torrent (Semiconductor sequencing).
Wat zijn eigenschappen van de Illumina methode? (3)
- Erg precies.
- Lage foutmarge.
- De 4 nucleotiden worden steeds tegelijk toegevoegd.
Wat zijn de 4 stappen van de Illumina methode?
- Verleng de keten met één base d.m.v. het gebruik van reversible terminators met een fluoroor.
- Identificeer de base met fluorescentie.
- Verwijder het fluoroor en deblokkeer de base.
- Ga verder met de volgende base.
Wat zijn eigenschappen van de Ion Torrent methode? (3)
- Meet de PH
- De 4 nucleotiden worden per cyclus één voor één toegevoegd.
- Nadeel: Als er meer dan 5 a 6 dezelfde nucleotiden achterelkaar worden ingebouwd, is dit lastig te onderscheiden.
Wat zijn de 3 stappen van de Ion Torrent methode?
- Voeg opeenvolgende de vier individuele basen toe.
- Bepaal de incorporatie van de base door het meten van de PH.
- Ga verder met de volgende base.
Wat zijn 2 manieren om next gen sequencing data te verwerken?
- Re-sequencing.
2. De Novo assembly.
Wat gebeurd er bij re-sequencing (mapping)?
Een alignement doen van alle sequenties tegen een bekend referentiegenoom.
Wat gebeurd er bij Novo assembly?
Gebruik de overlap tussen de fragmenten om een nieuwe consensus sequentie te maken.
Wanneer gebruik je de Novo Assembly methode?
Als je geen referentiegenoom hebt.
Wat betekent mapping?
De plek vinden waar een gesequenced fragment alignt met het referentiegenoom.
Wat zijn 2 voordelen en 2 nadelen van Re-sequencing?
Voordelen:
- Snel
- Kleine verschillen worden makkelijk opgepikt.
Nadelen:
- Je hebt een bestaande referentie nodig.
- Reads die niet mappen worden niet gebruikt en je mist dus nieuwe informatie.
Wat zijn 2 voordelen en 2 nadelen van De Novo assembly?
Voordelen:
- Geen vooroordelen.
- Grote verschillen worden gemakkelijk opgepikt.
Nadelen:
- Duurt lang.
- Je krijgt het genoom niet ‘sluitend’, omdat je met korte stukjes zit.
Wat geven Coverage, Depth of Coverage en Average depth of coverage aan?
Coverage = Hoe compleet is de sequentie, hoeveel % van het genoom is gesequenced. Vind je al je mutaties?
Depth of Coverage = Betrouwbaarheid. Hoeveel keer is elke base gecovered.
Average depth of coverage = Coverage x Depth of coverage.
Hoe groot moet je average depth of coverage zijn om mutaties op te sporen?
20x3 zijn. = 60gigabasen.
Wat doet de Oxford Nanopore?
Een enkele DNA string wordt door een porie gehaald. Nucleotiden worden gemeten terwijl ze door de porie gaan.
Wat wordt er verwacht van derde generatie sequencing:
5
- Single molecuul sequencing, dus geen PCR nodig.
- Lange reads mogelijk.
- Makkelijker om te mappen
- Geschikt voor de Novo assembly
- Geen fouten geïntroduceerd door PCR.
