Rick Orij DNA sequencing

Question 1

Wat is de definitie van het genoom?

Answer 1

De complete genetische samenstelling van een organisme, cel of virus.

Question 2

Wat is de definitie van het transcriptoom?

Answer 2

Geheel aan RNA moleculen

Question 3

Wat zijn de stappen van Sanger Sequencing?

Answer 3

DNA template + Primer –> DNA polymerase verlengt sequentie. –> Verlening stopt door het verwijderen van een zuurstofatoom. –> Fluorescentie wordt gemeten. –> Met behulp van een fluorescentie kun je aantonen bij welke base de verlenging gestopt is.

Question 4

Waarom is de maximale lengte van een Sanger read ~100bp? (2)

Answer 4

1. Grotere fragmenten zijn op een polyacrylamide gel niet goed te scheiden.
2. De sterkte van het fluorescente signaal neemt af vanwege het afnemende aantal moleculen van langere lengte.

Question 5

Wat is het verschil tussen Sanger en NGS?

Answer 5

Bij Sanger doe je maar een fragment tegelijk per reactie. Bij NGS een groot complex mengsel van random fragmenten per reactie.

Question 6

Hoe kun je bij NGS een groot complex mengsel van random fragmenten per reactie meten? 2 trucs.

Answer 6

1. Het scheiden van DNA fragmenten door verankering.

2. Real time sequencing.

Question 7

Wat is Real-time sequencing?

Answer 7

Basen worden geïdentificeerd op het moment dat ze worden ingebouwd door de polymerase.

Question 8

Op welke 2 manieren kun je DNA fragmenten scheiden?

Answer 8

1. Clonaal amplificeren.

2. Emulsie PCR.

Question 9

Wat gebeurt er met het originele template in clonal bridge amplification?

Answer 9

Het wordt na de eerste amplificatie weggewassen.

Question 10

Waar vindt emulsie PCR plaats?

Answer 10

vindt plaats in olie, daar zitten waterdruppels in met elk een bolletje en een dubbelstrengs DNA-fragment .

Question 11

Welke twee methodes zijn er om te real-time sequencing?

Answer 11

1. Illumina.

2. Ion Torrent (Semiconductor sequencing).

Question 12

Wat zijn eigenschappen van de Illumina methode? (3)

Answer 12

1. Erg precies.
2. Lage foutmarge.
3. De 4 nucleotiden worden steeds tegelijk toegevoegd.

Question 13

Wat zijn de 4 stappen van de Illumina methode?

Answer 13

1. Verleng de keten met één base d.m.v. het gebruik van reversible terminators met een fluoroor.
2. Identificeer de base met fluorescentie.
3. Verwijder het fluoroor en deblokkeer de base.
4. Ga verder met de volgende base.

Question 14

Wat zijn eigenschappen van de Ion Torrent methode? (3)

Answer 14

1. Meet de PH
2. De 4 nucleotiden worden per cyclus één voor één toegevoegd.
3. Nadeel: Als er meer dan 5 a 6 dezelfde nucleotiden achterelkaar worden ingebouwd, is dit lastig te onderscheiden.

Question 15

Wat zijn de 3 stappen van de Ion Torrent methode?

Answer 15

1. Voeg opeenvolgende de vier individuele basen toe.
2. Bepaal de incorporatie van de base door het meten van de PH.
3. Ga verder met de volgende base.

Question 16

Wat zijn 2 manieren om next gen sequencing data te verwerken?

Answer 16

1. Re-sequencing.

2. De Novo assembly.

Question 17

Wat gebeurd er bij re-sequencing (mapping)?

Answer 17

Een alignement doen van alle sequenties tegen een bekend referentiegenoom.

Question 18

Wat gebeurd er bij Novo assembly?

Answer 18

Gebruik de overlap tussen de fragmenten om een nieuwe consensus sequentie te maken.

Question 19

Wanneer gebruik je de Novo Assembly methode?

Answer 19

Als je geen referentiegenoom hebt.

Question 20

Wat betekent mapping?

Answer 20

De plek vinden waar een gesequenced fragment alignt met het referentiegenoom.

Question 21

Wat zijn 2 voordelen en 2 nadelen van Re-sequencing?

Answer 21

Voordelen:
- Snel
- Kleine verschillen worden makkelijk opgepikt.
Nadelen:
- Je hebt een bestaande referentie nodig.
- Reads die niet mappen worden niet gebruikt en je mist dus nieuwe informatie.

Question 22

Wat zijn 2 voordelen en 2 nadelen van De Novo assembly?

Answer 22

Voordelen:
- Geen vooroordelen.
- Grote verschillen worden gemakkelijk opgepikt.
Nadelen:
- Duurt lang.
- Je krijgt het genoom niet ‘sluitend’, omdat je met korte stukjes zit.

Question 23

Wat geven Coverage, Depth of Coverage en Average depth of coverage aan?

Answer 23

Coverage = Hoe compleet is de sequentie, hoeveel % van het genoom is gesequenced. Vind je al je mutaties?
Depth of Coverage = Betrouwbaarheid. Hoeveel keer is elke base gecovered.
Average depth of coverage = Coverage x Depth of coverage.

Question 24

Hoe groot moet je average depth of coverage zijn om mutaties op te sporen?

Answer 24

20x3 zijn. = 60gigabasen.

Question 25

Wat doet de Oxford Nanopore?

Answer 25

Een enkele DNA string wordt door een porie gehaald. Nucleotiden worden gemeten terwijl ze door de porie gaan.

Question 26

Wat wordt er verwacht van derde generatie sequencing:

5

Answer 26

1. Single molecuul sequencing, dus geen PCR nodig.
2. Lange reads mogelijk.
3. Makkelijker om te mappen
4. Geschikt voor de Novo assembly
5. Geen fouten geïntroduceerd door PCR.