Wardit Tigchelaar PCR

Question 1

Wat zijn de 3 algemene stappen va PCR?

Answer 1

1. Denaturatie 95*C (DNA wordt enkelstrengs)
2. Hybridisatie +- 60*C (Primers binden aan DNA)
3. Elongatie 72*C (DNA wordt gedupliceerd)

Question 2

Wat gebeurd er tijdens RT-PCR?

Answer 2

Er wordt van RNA weer cDNA gemaakt. ‘RNA afhankelijke DNA polymerase’

Gedaan door reverse transcriptase enzym.
RNA is erg onstabiel en breekt snel af. Daarom wordt er cDNA van gemaakt.

Question 3

Welke 3 soorten primers zijn er?

Answer 3

Oligo(dt) Primers
Random primers
Gen-specifieke primers

Question 4

Wat is een eigenschap van Oligo(dt) primers?

Answer 4

Gemaakt om te binden aan poly-a-staart.

Question 5

Wat zijn eigenschappen van random primers?

Answer 5

• Korte, willekeurige sequentie

- Omdat deze heel kort zijn is de kans groot dat ze ergens kunnen binden.

Question 6

Wat zijn Gen-specifieke primers?

Answer 6

• Gemaakt op basis van bekende sequentie.

- Worden vooral gebruikt voor microRNA’s

Question 7

Wat is de Ct waarde?

Answer 7

Na hoeveel cycli wordt een bepaalde drempelwaarde bereikt.

Question 8

Hoe minder cycli er nodig is om de Ct waarde te bereiken.. =

Answer 8

Hoe meer DNA er in het sample zat.

Question 9

Wat wordt er tijdens qPCR extra toegevoegd?

Answer 9

DNA bindend = SYBR Green

Hydroliserende probe = Taqman Probe

Question 10

Wat doet SYBR Green?

Answer 10

Bindt aan dubbelstrengs DNA, het is dus niet specifiek!
Straalt licht uit wanneer die verbonden is.
Meer licht = meer DNA.

Question 11

Wat zijn eigenschappen van Taqman?

Answer 11

• Bevat een probe = een DNA sequentie die je moet ontwerpen.
• Probe bindt aan complementair DNA.
• Probe ligt tussen de primers in.

Question 12

Wat bindt aan de taqman probe?

Answer 12

Aan taqman bindt een fluorophore, en een quencher = een onderdrukker.

Question 13

Hoe werkt Taqman?

Answer 13

Als er DNA gesynthetiseerd wordt en bij de probe komt, laat de fluorophore los en straalt die licht uit.
 Als de afstand tussen de fluorophore en de quencher groter wordt, komt er fluorescerend signaal. Elke cyclus meer fluorescentie.

Question 14

Wat doet Taq polymerase?

Answer 14

DNA afhankelijke DNA polymerase
- Optimum temperatuur 75-80*C
Geen proofreading, kan niet eigen fouten herstellen. –> Een polymerase met nuclease activiteit kan verkeerd geplaatste basen herkennen en verwijderen.

Question 15

Waarmee moet je rekening houden bij primer design?

Answer 15

• gDNA en cDNA contaminatie in het sample.
• Exon/intronen grenzen. = Een primer die de intronen in DNA overslaat maar wel bindt aan cDNA waar geen intronen meer in zitten.
• Flanking intron.
• Splice varianten.

Question 16

Welke samples heb je bij qPCR? (3)

Answer 16

1. Je onbekende samples
2. Een verdunningsreeks om een ijklijn te maken.
   - Wordt gemaakt uit een pooled sample = een sample met kleine hoeveelheden van je onbekende sample.
   - Al je onbekende samples moeten binnen de ijklijn vallen.
3. NTC als controle voor primer dimers en contaminatie. NTC bevat alles behalve je cDNA

Question 17

Wat is de log-lineaire fase?

Answer 17

Gebied waar de verdubbeling van DNA 100% plaatsvind.

Question 18

Wat doe je met de Baseline?

Answer 18

Achtergrond signaal weghalen.

-Rn: fluorescent signaal & deltaRN: Fluorescent signaal gecorrigeerd door de baseline.

Question 19

Wat is de Treshold?

Answer 19

• Ligt in het log-lineaire gebied
• Drempelwaarde, boven deze hoeveelheid fluorescentie is de amplificatie specifiek en significant.
• Als een lijn de treshold kruist kun je aflezen hoeveel cylci dat sample nodig had om door de drempelwaarde te gaan. = de Ct waarde