Vorlesung 9 Flashcards
Positionsspezifische DNA Rekombination
2 Arten & Bedeutung
CSSR (Konservative positions-spezifische Rekombination; kann zur Umkehr der Sequenz kommen) oder Transposition
Hauptursache für spontane Mutation
Schlüsselrolle bei viraler Infektion
Schlüsselrolle bei Entwicklung des Immunsysntems
Transposition
eine Position -> neue Position springen
50% des menschlichen Genoms aus Transposons
Phagenzyklus
normaler pathway: lytischer Zyklus, Bakterienzelle wird aufgelöst, Phagen freigesetzt
DNA Zircularisiert, exprimiert, Phagen assmbliert, Zelle lysiert, Freisetzung
T-Phagen haben nur lytischen Zyklus
Lysogener Weg: Zelle KANN lysiert werden; DNA als Prophage eingebaut und stummgeschalten
Prophage kann aktiviert werden und in lytischen Zyklus übergehen
Phagengenom, positionsspez DNA Rekombination
Phage hat Rekombinationsstelle, Bakteriengenom auch
Rekombinationsereignis möglich
Rekombinase/Integrase erkennt Sequenzen
3 Möglichkeiten: Insertion, Deletion (Rekombinationsstellen in in gleiche Richtung gerichtet); Inversion, wenn Rekombinationsstellen in verschiedene Richtung gerichtet
Rekobinationsstellen werden nämlich aneinander ausgerichtet-> Schleifenbildung bei Deletion, Haarnadel bei Inversion
Rekombinationsstllen, Aufbau, Ablauf
TAGC, flankiert von inversen Sequenzen
Rekombinasen sind tetramere, jeweils 2 UE binden an jeden Strang an die flankierenden invers laufenden Palindormsequenzen
2 UE tauschen Position und nehmen DNA Strang mit
dann Ligation
koservative Rekombination, Merkmale
kein ATP Verbruach, kein Energieverlust, Anzahl der Phosphodiester-Bindungen bleibt konstant
Serin Rekombinase
beide Stränge komplett durchgeschnitten
kovalente Bindung
SWAP DNA Partners, UE nehmen DNA mit
freie 3’ Enden, Rekombinase über 5’ Ende an DNA gebunden
Überkreuzung von Einzelsträngen, Holliday Struktur
Tyrosin Rekombinasen
Schnitte zeitlich versetzt
freie 5’ OH Gruppe, kovalente Bindung von P am 3’ OH
nur Einzelstrangschnitt (nick), 1.Überkreuzung, Holliday-Strktur, 2. Nick und Überkreuzung
tRNA gene
sicherer Hafen für Phagen
stem loop als Bindungsstelle
weil viel mehr tRNA Gene in E coli und Mensch als nötig
Cre (-> Cre Rekombinase)
Rekombinase aus Phage P1 (hat lysogenen und lytischen Zyklus)
im lytischen Zyklus liegt Phagen DNA wie als Plasmid vor
an beiden Enden der Phagen DNA Rekombinationsstellen loxP
Autausch der DNA Doppelstränge, kleiner Teil abgeschnitten, Plasmid entsteht aus linearer DNA
Cre/loxP System
Target Gen von 2 loxP Site flankiert
mit Cre Rekombinase soll Rekombination ausgelöst werden und Target Gen deletiert werden
1x Maus: Gen gefloxt
1x Maus: Cre mit Protomor des Gens eingebracht
Promotor für Cre
Eigenschaften
organspezifisch, entwicklungspezifisch, induzierbar
bakteriophage lambda
inwiefern Rekombination
integriert DNA als Prophage
macht das gleiche wie P1, nur Rekombinationsstellen nicht auf eigener DNA (attP auf eigener DNA, attB auf Bakterium)
lineare DNA-Enden mit kurzen einzelsträngigen, komplexmentären Abschnitten -> Rezirkularisierung
Salmonella
Regulation Flagellin Gene
Rekombinatiosstellen
Regulation der Flagellin-Gene H1 und H2
Region dazwischen invertable Segmente
H1 überlebt länger
ON: H2 exprimiert und H1 Repressor
DNA-Transposons Aufbau
Tranpoasase,
flankiert von target site repeats
dazwischen noch inverted repeats
TN10
hat Präferenz, in frisch replizierter DNA zu translokieren
aus 2 IS-Elementen zusammengesetzt
IS10L defective
IS10R mit Transposase-Gen
stellt sicher, dass TN10 nicht übermäßig mobil ist
Replikativer Mechanismus DNA Transposons
Transposons an îrgendeiner Stelle, springt
Transposase erkennt transposon an IR-Sequenzen, Strang geschnitten aber nur nick, 3’ OH frei
Integration in target DNA: Bildung eines DNA Intermediats mit Donor und Akzeptor
Repliaktion durch das Transposon, Kopie an 2. Stelle eingefügt, indem Transposase erneut schneidet
durch Ligase geschlossen
LTR-Retrotransposons
von Protomor weit vorne aus transkribiert
RNA durch RT ins cDNA
3’ Enden abgeschnitten
Strangtransfer
DNA Repair und Ligation
Transposon Cut and Paste Mechanismus / nicht-replikativer Mechanismus
Transposase bindet an terminal inverted repeats (2x), DNA-Krümmung, Bildung Synapse
Transposase schneidet Donor-DNA direkt außerhalb der IRs und löst Transposon heraus
freies 3’OH-Ende, Transfer und Umesterung in Target DNA
DNA Pol und Ligase
WICHTIG: Schnitt des 2. Strangs
Poly-A-Retrotranspons; Merkmale
PolyA-Schwanz am 3’ der RNA für RT
Integrationsmechanismus: target primed reverse transcription
Integration in T-reiche Sequenzen
Überlebensstrategie von Transposons
sind mutagen und wollen deshalb Selektion vermeiden
>Vermittlung von Resistenzen (Antibiotika)
>Safe Havens wir tRNA Operons (viele Kopien, ein Defekt schadet nicht)
>Intron-Mimikry
LINE-Elemente
Long interspaced nuclear elements
Klasse transponierbarer Elemente in Eukaryoten, die über RNA-Zwischenstufe replizieren
keine LTRs
PolyA-Sequenz
ORF1: RNA Binding Protein
ORF2: Reverse transcriptase/ Endonuclease
Yeast Ty Element
ein LTR Retrotransposon, ähnelt Retroviren
integriert häufig in tRNA gene (safe havens)
produzieren auch strukturelle Proteine, die als Virus like Particels verpackt werden
PolyA-Retrotransposons, Mechanismus
wird transkribiert
RNA mit PolyA-Schwanz
Proteine werden exprimiert und binden an 3’ der eiogenen RNA und suchen T-reiche Sequenzen (Ribonucleoproteinkomplex)
ORF2 (Endonuclease-Aktivität) schneidet Ziel DNA (nick), freie 3’ als Primer für RT
ORF2 verwendet LINE RNA als Vorlage, beginnend am PolyA-Schwanz, währenddessen auch anderer Strang geschnitten
Integration als cDNA
