Vorlesung 10 Flashcards
RNA Polymerase- Unterschiede zur DNA Polymerase
nicht Primer-abhängig -> de novo Synthese
RNA bleibt nicht mit DNA gepaart
höhere Fehlerrate: 10^-4 statt 10^-7 (trotz Reparaturmechanismen)
bis auf Telomere und Centromere alles transkribiert
Aufbau und Anzahl RNA Polymerasen
aus vielen verschiedenen UE aufgebaut
bakterielle einfacher: alpha, beta, omega UE
aechaealle: 6 weitere UE
Eukaryoten: min. 3 Polymerasen, Nummerierung nach Häufigkeit und Identifizierung
RNA Pol I von Eukatyoten synthetisiert
Synthese rRNA
RNA Pol II von Eukaryoten synthetisiert
Synthese von mRNA
RNA Pol III von Eukaryoten synthetisiert
Snythese von kleinen RNAs
tRNAs, snRNAs, 5S-rRNA
am meisten UE
Inititation Transkription (allgemeiner Ablauf, ohne Faktoren)
RNA Polyerase dockt an RNA an, an Promotor
Promotor definiert Transkriptionsstart: +1 & gewinklter Pfeil ->Bildung geschlossener Komplex
Einzelstränge am Promotor aufgeschmolzen =offener Komplex
Beginn der RNA Synthese
Elongation: allgemeiner Ablauf
Polymerase verlässt Promotor und Synthetisiert komplementär zum template Strang
Termination
wo, was
am Stoppsignal eingeleitet
Polymerase verlässt DNA und lässt RNA frei
Pol - Promotor - Interaktion
keine hohe Affinität
keine Sequenzspezifität (wegen Elongation)
Affinität an Promotor durch sigma-Faktor (TF-Faktor sigma70)
sigma70 interagiert mit Pol (Core)-> Holoenzym erkennt Promotor
sigma70 Promotoren
-10 Region
-35 Region
bilden Standardpromotor, durch Alignments erkannt, Konsesus-Sequenz (Durchschnitt); Konsensus= stärkster Promotor
-> steuert Proteinmenge über Transkriptionsstärke
sigma70 Promotoren - Variationen
Abweichungen: zusätzliche Elemente, z.B. UP-element, das Promotor verstärkt
verkürzte Promotoren: extended -10, dadurch -35 kompensiert
Erkennung Promotor durch sigma70
Sigma70 wird von N nach C benannt
Region 2 erkennt -10 Sequenz
Region 4 erkennt -35 Seuqenz
Region 4 helix-turn-helix-Motiv
alternativer Name -10 Region
Pribnow Box
Sigma Faktoren, übergordnete Funktion neben Pol-Aktivierung
Möglichkeit der Genregulation (zeitliche Koordination, Kaskade)
Beispiel: Sporenbildung bei B. subtilis
Phage SPO1 - koordinierte Genexpression dank sigma-Promotoren
hat Gene, die vom Wirts sigma 70 erkannt werden -> Expression früher Phagenproteine, u.a. sigma28
sigma28 hat höhere Affinität zur RNA Pol -> Wirts RNA Polymerase an Gene für mittlere Phagengenge gebracht, (Assemblierung) , u.a. sigma 34
mit sigma34 Faktor späte Gene für Assembly der Phagenproteine abgelesen
UP-element
bei Promotoren der rRNA
bindet kein sigma Faktor,
erhöht Affinität der Pol, indem es alpha-Untereinheiten der RNAP bindet
Elongation
Reaktions-Ebene
3’ der RNA greift PP an
PP hydrolysiert
Fehlerrate RNA Polymerisation
10^-4
höher als bei DNA-Pol
trotz 2 Korrektormechanismen:
1. Pyrophosphorolytisches Editing: klassiche Rückreaktion, enzymatisch katalysiert, weil PP nicht sofort hydrolysiert wird, wenn flasches Nukleotid eingebaut wurde
2. Hydrolytisches Editing: PP schon weg aus kat. Zentrum, Enzym entfernt Nukleotid-Monophospat aus RNA und baut neue ein (Backtracking), NMP abgespalten
insb. Problem bei homopolymeren stretches
Termination bei Prokaryoten
Stopsequenzen (keine Stopcodons) benötigt: Terminatoren
rho unabhängiger Terminator
kein zusätzlicher Faktor
erkennt man an Anordnung von 2 gegenläufigen Seqeunzen gefolgt von TA-bp
intrinsicher Terminator
wird in RNA umgeschrieben
erst RNA gibt Terminationssignal: bildet hairpin, gefolgt von u stretch = eigentlicher Terminator
U-> schwache bp mit A, Abdiffundieren der RNAP
A-U-Basenpaare: A-Helix durch U erzwungen, relativ instabil
A-strech wäre weniger instabil, würde eher B helix mit DNA-T bilden
Haitpin interferiert mit Elongationskomplex
schwache A-U basenpaare tragen zur Dissoziation bei
deutlich häufiger als tho-abhängige Termination
rho-abh Terminator
C-reiche Seqeunz (40%)
sequenzunabhängig folgen 3 Basen, an einer davon stoppt Polymerase
Pausieren genutzt, rho-Faktor kommt dazu, bindet an RNA
nach Promotor rut site, wandert unter ATP Verbrauch bis zur Polymerase
ändert Konformation der Polymerase, diffundiert ab
eukaryotischer Core Promotor (POLII)
4 basale Elemente: hier binden General Transkription Factors
Inr: Transkirptionsstart, Initiator, TFIID bindet
BRE: TFIIB Recoginition Element
TATA: TATA-Box, TATA box binding Protein TBP
DPE: Downstream Promotor Element, TFIID bindet
Enhancer: Merkmale und Unterschied zum Promotor
liegen weit stromauf-/abwärts vom Promtor
Promotor allein ausreichend für Transkription
Enhancer: kann alleine keine Transkription starten, verstärkt aber die Promotor-Funktion, wirkt unabhängig von seiner Orientierung, nicht positionsspezifisch; Grund: Isolatoren, die Promotoren trennen
GTFs
erfüllen eigentlich Funktion des sigma Faktors bei Eukaryoten
generaol transcription factors
Ablauf GTFs
erst bindet TBP, dann TFIIB
landing Platform auf DNA für RNA Pol-> Präinitiationskomplex
C Terminus bindet an GTFs
TFIIH kommt hinzu: vom geschlossenem in offenen Komplex
Abortive Initatition oder Transkription durch Phosphoryleriung der C-term- Domäne der RNAP
CTD: Aufbau
Heptatpeptid-Wiederholungen
C terminale Domäne der RNA Pol
TATA binding Protein
Bedeutung und wie Bindung
bindet nicht über helix loop helix motiv oder alpha Helix, sondern erkennt über kleine Furche und beta-Faltblatt
bindet Dimer aus 2 identischen UE
DNA bei Bindung stark abgewinkelt -> kleine Furche nach außen
TATA erkannt, obwohl in kleiner Furche nicht zwischen bp unterschieden werden kann;
steckt Phe zum base stacking in bp rein; nur wenn die reinpassen, dass DNA stabil und TATA Box erkennt
an allen eukaryotischen Promotoren beteiligt
in vivo Initiationskomplex
zusätzlicher Mediator aus vielen verschiedenen Proteinen (TF)
An Mediator binden Aktivatoren, binden an distale Kontrollemenete
an Aktivatorren binden auch Chromatin Remodeller und HAT
Elongation der Transkription bei Eukaryoten
Polymerase stoppt (Transkriptional Pausing), RNA kann währenddessen von DNA abgehen
Elongationsfaktoren sorgen dafür, dass DNA RNA wieder gepaart wird
gibt auch hier Proof Reading analog hydrolytisches Editing
C terminale Domäne der eukaryotischen RNA Polymerase: Funktion in Elongation
hilft auch bei Reifungsschritten
CTD wird dephosphoryliert
Capping enzyme bindet, wartet auf 5’ Ende und bindet dann stattdessen an RNA
Phosphorylierungsmuster geänder, Splicing machinerie bindet, wandert dann zu RNA
neues Phosphrylierungsmuter; Polyadenylierungsproteine und RNA schnitt-Proteine rekriert, die spingen dann auf DNA
sorgt mit unterschieldichen Phosphorylierngsmustern dafür, dass Prozesseiungsmacschinerie zur richtigen Zeit am richtigen Ort rekrutiert wird
Capping
gamma-Phosphat vom A am 5’ Ende abgespalten
Guanylyltransferase sorgt dafür, dass Pp von GTP abgespalten wird, während beta-Phosphat der RNA am alpha-Posphat von GTP angreift -> 5’-5’-Bindung
mit Methyltransferase 7 methyl G gebildet
wenn 1. Base ein A, dann N6-methlyiert
außerdem an 1. und 2. Base der 2’OH der Ribose zum Methoxyester
Polyadenylierung
Faktoren CPSF und CstF binden an C terminale Domäne der RNAP und binden dann an RNA; sobald A Signal transkribiert ist;
sorgen dafür, dass RNA geschnitten und Poly A Polymerase rekrutiert wird
Poly-A-Schwanz gebildet und Poly A binding Proteine, die A stretch stabilisierten, rekrutiert
Termination der RNA Pol in Eukaryoten
alle CTD Kinasen fallen ab, mehr Phosphatasen rekriteirt
desphosphorylierung der CTD
Polymerase verliert Aktivität und Affinität zur DNA = Prozessivität
Pol fällt ab
benötigt also keine Signalsequenz auf DNA oder RNA, sondern auf Pol
RNA Pol I Promotor
für rRNA
hat Core Promotor und zudem UCE (upstream control element) aus Sequenzen A und B, das Promotor verstärkt
UBF (upstream binding factor) bindet an UCE
SL1 und TBP binden an Core Promotor, die beiden zusammen rekrutieren RNAPI = Landing Platform
RNA Pol III Promotor
für tRNAs, 5srRNA, U6 snRNA
sind downstream nach Transkriptionsstart
Promotor wird mit transkribiert: Promotor 0 aktive Transkriptionseinheit
BoxA und BoxB dadurch in tRNA Armen
SINE/Alu elemente sind durch Pol III entstanden, haben also ihren Promotor dabei
an BoxA und Box B bindet TFIIIC und vorher TFIIIB und TBP
gibt Ausnahmen mit upstream promotor
TBP
winziger universeller TF in Eukaryoten
bindet an TATA Box
TATA binding Protein
Unterscheidung RNA Pol mit alpha Amanitin
aus grünem Knollenblätterpilz
blockiert RNA Pol II in allen Organismen, irreversibel
mitochondriale RNA Polymerase
2 mRNAs und eineige tRNAs codiert
aus einer UE mit 2 Zusatzfaktoren
Gemeinsamkeiten mit Prokaryoten:
einziges Polypeptid
Initiationsfaktor ähnelt sigma70 Faktor
hemmbar durch Rafampicin
ähnliche Promotoren zu T3 und T7
strukturelle Ähnlichkeit zu T3 oder T7 RNA Polymerasen
wie bindet RNAP an -35 und -10?
Sigma Faktor wird gestreockt, damit er an beide Regionen bindet
75Anström Distanz
Abortive Initiation
RNAP bleibt oft an Promotor hängen, weil sigma Faktor nicht abdiffundiert
kleine RNA-Polymere entstehen, die bald wieder abgebaut werden
