Vorlesung 4 Flashcards
Entdeckung Grundzüge der DNA Polymerisation (Replikation) durch
Arthur Kornberg
Freigesetzte Energie bei Polymerisation der DNA
-7 kcal/mol; weil PP hydrolysiert
Pyrophosphat durch Phyrophosphatase aus Gleichgewicht entfernt
2 Metallionen Mechanismus
es gibt Template Strang und Primer auf komplementärem Strang
am 3’ Ende des Primers dNTP angehängt
neues Nukleotid bindet an template
2 Metallionen für Positionieren des neunen dNTP verantwortlich
Metallion A verdrängt Proton vom 3’ Ende -> Sauerstoff negativ
3’ O greift Nucleophil am P an
Pyrophosphat wird abgespalten
Metallion B koordiernt Pyrophosphat
Positionierung der 2 Metallionen
durch saure Reste der Polymerase
warum keine Verlängerung an 5’ Ende
wäre energetisch gleich
wässriges Milieu-> Triposphat kann hydrolysiert werden -> manchmal an 5’ keine Polymerisation möglich; bei 5’ Anbau könnte am ganzen Strang nicht verlängert werden
Polymerase hat Exonuclease-Aktivität, um falsche Nukleotide wieder abzuspalten
Folgestrang
Replikation läuft auf Folgestrang von Replikationsgabel weg
DNA Polymerase stoppt immer wieder
Okazaki-Fragmente (bei Eukaryoten deutlich kürzer)
viele RNA Primer
DNA Polymerase: dNTP oder rNTP
kein aktiver Selektionsmechanismus für dNTPs, wartet bis das richtige reindiffundiert
es gibt mehr rNTPs als dNTPs
Region mit diskriminatorischen Aminosäuren
Bindungstasche nur für Desoxyribosen zugänglich
bei rNTP wird Ribose anders platziert, kein nucleophiler Angriff des 3’ möglich
wie richtiges dNTP durch DNA-Polymerase eingebaut
andere Positionierung von Ribose und Phosphatgruppe, wenn keine H-Brücken zwischen Basen
kein Angriff von 3’ OH an P möglich
O-Helix der DNA Polymerase
am katalytischen Zentrum
hat 2 basische Reste und Tyrosin (aromatisch)
O-Helix wird auf angelagertes (nicht-eingebautes) Nuleotid abgesenkt
Base macht (pi-pi-WW) stacking mit Tyrosin
basische Reste koordinieren Metallionen und Phosphat
–> trägt zur Genauigkeit der DNA Polymerase bei
Fehlerrate von DNA Polymerase
sehr gering: 10^-9
proof-reading
2. katalytiscches Zentrum in der Handfläche: Polymerisation
falsche Base aus dem katalytischen Zentrum rausgedrängt -> katalytisches Zentrum der Exonuclease
Exonuclease ist 3’-> 5’ Exonuclease
spaltet falsches Nucleotid ab
Primer klappt wieder hoch, Polymerase kann wieder richtige Nukleotide einbauen
falsche Base erkannt an
keine Basenpaarung (H-Brücken)
nur an 3’ an Primer angehängt
alle DNA Polymerasen brauchen
Primer
RNA Polymerasen nicht -> RNA Welt wahrscheinlich
Primer Entfernung
wird durch RNAse H entfernt (arbeitet nur am Hybrid)
oft nicht vollständig wegen Sterik
DNA Polymerase (Reparaturpolymerase) schließt Lücke
DNA Ligase schließt nick
Primase
macht kruzen (10 nt) RNA Primer für DNA Polymerase
Helicase
trennt DNA Stränge
ringförmig geschlossenes Enzym, das unter ATP Verbrauch Wasserstoffbrücken auftrennt
fädelt auf eines der DNA Stränge auf
wandert 5’ -> 3’
verschiedene DNA Polymerasen bei Prokaryoten
Pol I und II: reine Reparatursysteme
Pol III Core: Kern, geringere Prozessivität, rechte Hand
Pol III Holoenzym: Komplex mit anderen Enzymen, hohe Prozessivität, DNA Replikation
Prozessivität einer Polymerase
abhängig von der Verweildauer an Matrize
wie viele Nukleotide eingebaut werden, bevor die Polymerase abfällt
ist nicht die Geschwindigkeit!
sliding clamp
circuläres Protein aus 2+ Untereinheiten, die wie eine Klammer ineinander verhakt sind
sorgt dafür, dass Polymerase nicht von DNA abfällt
sorgt für hohe Prozessivität
Prokaryoten: beta-Protein
Eukaryoten: PCNA, proliferating cell nuclear antigen
Clamp loader
molekulare Zange
kann beta-Clamp binden und geöffnet halten
DNA durchgefädelt
ATP Hydrolyse-> clamp unter Spannung ineinander verhakt
= gamma-Komplex
Polymerase eta
Leading strang
sehr geschlossen
umgibt DNA fast schon wie sliding clamp
Polymerase delta
lagging strand
weiter geöffnet
geringere Prozessivität als eta
Tau-Protein
halten jeweils eine Polymerase fest
Clamp loader und sliding clamp gebunden
bilden alle zusammen Holoenzym
Core-Enzym: nur die Polymerasen allein
Koordiniert Synthese von Leading und lagging strang
SSB
single strand binding protein
bindet alle singe strands während Repliaktion
damit sich ssDNA nicht zusammenlagert
Schützt vor Hydrolyse
kooperatives Bindeverhalten (positiv)
DNA Ligase
braucht ATP (Phagenligasen) oder NAD+ (Bakterien) als Cofaktor
Lysinrest in aktivem Zentrum
AMP wird auf Enzym und dann auf DNA übertragen
am Ende AMP abgespalten
lagging Strang bildet (Struktur)
Schleife
DNA Replikation in Bakteriophage M13 allgemein
filamentöser Phage
zirkuläres ss+DNA Genom
+: identisch zur mRNA, kann direkt Codons ablesen
infiziert nur Bakterien mit F+ Pilus
DNA Replikation in Bakteriophage M13 : - Strang
injiziiert Genom, dazu - Strang hergestellt, wie Plasmid vermehrt
erst SSB, außer bei einer Hairpin Struktur
hier dann Primer
Pol III synthetisiert ausgehend hiervon dsDNA
= leading strand synthese
Herstellung + Strang in Bakteriophage M13
Nick durch Endonuclease
3’ Ende von Polymerase genutzt, läuft um - Strang herum und synthetisiert + Strang
Rollling circle mechanism
auch leading strang Synthese
Bakteriopaage phi Y174: Synthese von +/- Strang
-Strang: lagging strand Synthese
+ Strang: leading strand Synthese
Genauigkeit der DNA Polymerase durch
diskriminatorische AS -> keine rNTPs
H-Brücken zwischen komplementären Basen
O-Helix
Proffreading durch 3’ - 5’ Exonuklease-Aktivität
DNA Polymerasen in Eukaryoten
welche macht was?
alpha: Primer Synthese
beta: Basenexzisionsreparatur
gamma: Mitochondrien
delta: Lagging Strand
eta: Leading strand
