Vorlesung 4

Question 1

Entdeckung Grundzüge der DNA Polymerisation (Replikation) durch

Answer 1

Arthur Kornberg

Question 2

Freigesetzte Energie bei Polymerisation der DNA

Answer 2

-7 kcal/mol; weil PP hydrolysiert
Pyrophosphat durch Phyrophosphatase aus Gleichgewicht entfernt

Question 3

2 Metallionen Mechanismus

Answer 3

es gibt Template Strang und Primer auf komplementärem Strang
am 3’ Ende des Primers dNTP angehängt
neues Nukleotid bindet an template
2 Metallionen für Positionieren des neunen dNTP verantwortlich
Metallion A verdrängt Proton vom 3’ Ende -> Sauerstoff negativ
3’ O greift Nucleophil am P an
Pyrophosphat wird abgespalten
Metallion B koordiernt Pyrophosphat

Question 4

Positionierung der 2 Metallionen

Answer 4

durch saure Reste der Polymerase

Question 5

warum keine Verlängerung an 5’ Ende

Answer 5

wäre energetisch gleich
wässriges Milieu-> Triposphat kann hydrolysiert werden -> manchmal an 5’ keine Polymerisation möglich; bei 5’ Anbau könnte am ganzen Strang nicht verlängert werden
Polymerase hat Exonuclease-Aktivität, um falsche Nukleotide wieder abzuspalten

Question 6

Folgestrang

Answer 6

Replikation läuft auf Folgestrang von Replikationsgabel weg
DNA Polymerase stoppt immer wieder
Okazaki-Fragmente (bei Eukaryoten deutlich kürzer)
viele RNA Primer

Question 7

DNA Polymerase: dNTP oder rNTP

Answer 7

kein aktiver Selektionsmechanismus für dNTPs, wartet bis das richtige reindiffundiert
es gibt mehr rNTPs als dNTPs
Region mit diskriminatorischen Aminosäuren
Bindungstasche nur für Desoxyribosen zugänglich
bei rNTP wird Ribose anders platziert, kein nucleophiler Angriff des 3’ möglich

Question 8

wie richtiges dNTP durch DNA-Polymerase eingebaut

Answer 8

andere Positionierung von Ribose und Phosphatgruppe, wenn keine H-Brücken zwischen Basen
kein Angriff von 3’ OH an P möglich

Question 9

O-Helix der DNA Polymerase

Answer 9

am katalytischen Zentrum
hat 2 basische Reste und Tyrosin (aromatisch)
O-Helix wird auf angelagertes (nicht-eingebautes) Nuleotid abgesenkt
Base macht (pi-pi-WW) stacking mit Tyrosin
basische Reste koordinieren Metallionen und Phosphat
–> trägt zur Genauigkeit der DNA Polymerase bei

Question 10

Fehlerrate von DNA Polymerase

Answer 10

sehr gering: 10^-9
proof-reading
2. katalytiscches Zentrum in der Handfläche: Polymerisation
falsche Base aus dem katalytischen Zentrum rausgedrängt -> katalytisches Zentrum der Exonuclease
Exonuclease ist 3’-> 5’ Exonuclease
spaltet falsches Nucleotid ab
Primer klappt wieder hoch, Polymerase kann wieder richtige Nukleotide einbauen

Question 11

falsche Base erkannt an

Answer 11

keine Basenpaarung (H-Brücken)
nur an 3’ an Primer angehängt

Question 12

alle DNA Polymerasen brauchen

Answer 12

Primer
RNA Polymerasen nicht -> RNA Welt wahrscheinlich

Question 13

Primer Entfernung

Answer 13

wird durch RNAse H entfernt (arbeitet nur am Hybrid)
oft nicht vollständig wegen Sterik
DNA Polymerase (Reparaturpolymerase) schließt Lücke
DNA Ligase schließt nick

Question 14

Primase

Answer 14

macht kruzen (10 nt) RNA Primer für DNA Polymerase

Question 15

Helicase

Answer 15

trennt DNA Stränge
ringförmig geschlossenes Enzym, das unter ATP Verbrauch Wasserstoffbrücken auftrennt
fädelt auf eines der DNA Stränge auf
wandert 5’ -> 3’

Question 16

verschiedene DNA Polymerasen bei Prokaryoten

Answer 16

Pol I und II: reine Reparatursysteme
Pol III Core: Kern, geringere Prozessivität, rechte Hand
Pol III Holoenzym: Komplex mit anderen Enzymen, hohe Prozessivität, DNA Replikation

Question 17

Prozessivität einer Polymerase

Answer 17

abhängig von der Verweildauer an Matrize
wie viele Nukleotide eingebaut werden, bevor die Polymerase abfällt
ist nicht die Geschwindigkeit!

Question 18

sliding clamp

Answer 18

circuläres Protein aus 2+ Untereinheiten, die wie eine Klammer ineinander verhakt sind
sorgt dafür, dass Polymerase nicht von DNA abfällt
sorgt für hohe Prozessivität
Prokaryoten: beta-Protein
Eukaryoten: PCNA, proliferating cell nuclear antigen

Question 19

Clamp loader

Answer 19

molekulare Zange
kann beta-Clamp binden und geöffnet halten
DNA durchgefädelt
ATP Hydrolyse-> clamp unter Spannung ineinander verhakt
= gamma-Komplex

Question 20

Polymerase eta

Answer 20

Leading strang
sehr geschlossen
umgibt DNA fast schon wie sliding clamp

Question 21

Polymerase delta

Answer 21

lagging strand
weiter geöffnet
geringere Prozessivität als eta

Question 22

Tau-Protein

Answer 22

halten jeweils eine Polymerase fest
Clamp loader und sliding clamp gebunden
bilden alle zusammen Holoenzym
Core-Enzym: nur die Polymerasen allein
Koordiniert Synthese von Leading und lagging strang

Question 23

SSB

Answer 23

single strand binding protein
bindet alle singe strands während Repliaktion
damit sich ssDNA nicht zusammenlagert
Schützt vor Hydrolyse
kooperatives Bindeverhalten (positiv)

Question 24

DNA Ligase

Answer 24

braucht ATP (Phagenligasen) oder NAD+ (Bakterien) als Cofaktor
Lysinrest in aktivem Zentrum
AMP wird auf Enzym und dann auf DNA übertragen
am Ende AMP abgespalten

Question 25

lagging Strang bildet (Struktur)

Answer 25

Schleife

Question 26

DNA Replikation in Bakteriophage M13 allgemein

Answer 26

filamentöser Phage
zirkuläres ss+DNA Genom
+: identisch zur mRNA, kann direkt Codons ablesen
infiziert nur Bakterien mit F+ Pilus

Question 27

DNA Replikation in Bakteriophage M13 : - Strang

Answer 27

injiziiert Genom, dazu - Strang hergestellt, wie Plasmid vermehrt
erst SSB, außer bei einer Hairpin Struktur
hier dann Primer
Pol III synthetisiert ausgehend hiervon dsDNA
= leading strand synthese

Question 28

Herstellung + Strang in Bakteriophage M13

Answer 28

Nick durch Endonuclease
3’ Ende von Polymerase genutzt, läuft um - Strang herum und synthetisiert + Strang
Rollling circle mechanism
auch leading strang Synthese

Question 29

Bakteriopaage phi Y174: Synthese von +/- Strang

Answer 29

• Strang: lagging strand Synthese
  + Strang: leading strand Synthese

Question 30

Genauigkeit der DNA Polymerase durch

Answer 30

diskriminatorische AS -> keine rNTPs
H-Brücken zwischen komplementären Basen
O-Helix
Proffreading durch 3’ - 5’ Exonuklease-Aktivität

Question 31

DNA Polymerasen in Eukaryoten

Answer 31

alpha: Primer Synthese
beta: Basenexzisionsreparatur
gamma: Mitochondrien
delta: Lagging Strand
eta: Leading strand