Vorlesung 11

Question 1

Exon und Intron stehen für

Answer 1

Expressed Region und intervening region

Question 2

Introns

Answer 2

Gene haben 1-360 Introns
bis zu 800 kb lang, meist größer als Exon (150bp)
Coding Region &laquo_space;Noncoding Region, teils <10%
Transkriptlänge bis zu 2,4Mbp
Alternatives Splicing ermöglicht viele verschiedene Versionen eines Proteins

Question 3

Transkriptionsgeschwindigkeit RNAP

Answer 3

40 nt/sek
-> prämRNA

Question 4

Splice sites: Aufbau

Answer 4

innterhalb des Introns ersten beiden und letzten beiden bp hochkonserviert; könnte man als “GTAG Regel” bezeichnen
bis zu 6bp auch mäßig konserviert
5’ und 3’ splice cite umfasst auch kleine Bereiche der Exons
gibt branch site, wo immer A, näher an 3’ als Mitte des Introns
Inzwischen auch ATAC Introns bekannt

Question 5

Mechanismus Splicing

Answer 5

2 Transesterfizierungen / Umesterungen
Anzahl Phosphodiesterbindungen konstant
Branch-A mit 2’OH durch Mg Proton abstrahiert; O greift Phosphordiesterbindung am Übergang Exon1-Intron an
neue PE-Bindung zwischen Intron-Anfang und 2’OH (Lasso/Lariat-Struktur)
freie 3’OH-Gruppe am Exon wird aktiviert, greift Phosphordiesterbindung an Intron-Exon-Grenze an

Question 6

Struktur am Branch point nach dem Spleißen

Answer 6

am Adenosin sind Phosphordiesterbindung am 5’.3’ und 2’
am 2’ GU von Anfang des Introns

Question 7

Spliceosom

Answer 7

snRNP Assembly; small nuclear ribunucleoproteins
U1 an 5’ Ende des Introns; BBP am branchpoint, U2Af nach BBP
U2Af hilft, BBP zu positionieren
U2 ersetzt danach BBP
snRNP-Hilfsfaktoren U4, U5, U6 verdrängen U2Af
U1 entfernt
U4 entfernt, was Sturktur von U5 und U6 ändert, werden katalytisch aktiv

Question 8

warum Introns so lang

Answer 8

Alternatives Splicing möglich
Branch point immer gleich; 5’ und 3’ können variieren
müssen aber in Frame mit Exon davor und danach sein und müssen Codierend sein

Question 9

Fehler beim Splicing (nennen)

Answer 9

Exon skipping
pseudo splice-site selection

Question 10

Vermeiden von Spleißfehlern

Answer 10

1. Spiceosom Assembly während Transkription: an C-Term der RNAP, wechselndes Phosphorylierungsmuster, Splicing Maschinerie springt beim 1. 5’ spice site auf mRNA
2. SR-Proteine (Ser/Arg-rich) binden an Splicing exhancer, zB. Exonic Splicing Enhancer; ESE rekrutieren Splicing Proteine

Question 11

Nutzen von Alternativem Spleißen

Answer 11

Alt. Spl. wird vom Organismus forciert
z.B. humanes Troponin Gen -> alpha oder beta Troponin T
oder SV40 (dsDNA Virus): T-Antigen

Question 12

Regulation von Alternativem Splicing mit Spicing Enhancer

Answer 12

ESE und ISE (Exonic/ Intronic Splicing Enhancer) Proteine binden Aktivator-Proteine (SR-Proteine), die Splicosom rekrutieren
kommt drauf an, ob bestimmte SR Proteine in einer Zelle exprimiert werden
wenn SR Proteine nicht vorhanden, kein Spleicen

Question 13

Alternatives Splicing durch Splicing Silencers

Answer 13

ESS oder ISS, binden Repressor- Protein (hnRNP)
nicht exprimiert: Splicing Machinerie zusammengelagert und gespleißt
SS exprimiert, verhindern Assemblierung von Spleicosoms, kein Spleißen

Question 14

Möglichkeiten des Alternativen Spleißens

Answer 14

alternative 5’ und 3’ splice sites
Intron Retention: Intron wird gar nicht rausgespleißt
Exon skipping: ein Exon alternativ als Intron behandelt; geht verloren
Mutually exclusive Exons: in einem Transkript das eine, im anderen das andere Exon

Question 15

Alternatives Spleißen erklärt

Answer 15

geringes menschliches Genom
weniger humane Gene als angenommen
bis zu 75% des humanem Genoms mit alternativem Splicing (viel mehr als bei anderen Organismen)

Question 16

Exon Shuffling

Answer 16

Proteine modular aufgebaut
durch Exon Intron Struktur widergespiegelt
durch Alternatives Splicing Varianten mit mehr/weniger Domänen möglich
Intron/Exon Grenzen oft identisch mit Domänen Grenzen
einzelne Exons codieren unabhängig für Protein-Domänen

Question 17

neue Gene durch Exon Duplikation

Answer 17

Intron/Exon Stuktur -> Genom gut evolvierbar
durch modularen Aufbau neue Gene durch Exon Shuffling möglich
kann durch Rekombination/ unequal crossing over passieren oder durch Duplication of domains
auch Vergrößerung des Proteins möglich

Question 18

Exon Transfer

Answer 18

relativ häufig
Bildung neuer Gene durch Kombination von Domänen: Exon Shuffling, Exon Duplication

Question 19

Gruppe I Introns
Merkmale, Vorkommen, Aufbau

Answer 19

nicht von Spleiceosom herausgeschnitten
kleiner
hochstruktriert
falten sich auf RNA Ebene in bestimmte Strukturen
brauchen kein Protein, ist nämlich Ribozym mit katalytischer Aktivität
in Hefen, Ciliaten, Bakterien und Bakteriophagen

Question 20

Gruppe I Introns Mechanismus

Answer 20

2 Umtesterungen
kein Branch point
externes GTP von Intron gebunden, davon 3’ OH aktiviert, das erste Grenze angreift, danach greift 3’ OH des Exons (aktiviert) 2. PE Bindung an, dadurch lineares Intron mit extra G am 5’ und gespleißte mRNA

Question 21

Gruppe II Introns: Aufbau

Answer 21

kann sich auch selbst rausschneiden ohne Protein
aber andere Stuktur als Gruppe I Introns
gleiches Vorkommen: Hefen, Ciliaten, Bakterien, Bakteriophagen
bildet zentrales Rad, flankiert von 5’ und 3’ Ende, davon 6 Domänen abgehend
in Domäne 6 immer nicht basengepaartes A = dient als branch point

Question 22

warum Gruppe II Introns nicht mehr in Eukaryoten

Answer 22

super effiziernt, ermöglicht aber kein alternatives Spleißen
Spleiceosom geht aber aus Gruppe Ii Introns hervor

Question 23

Gruppe I und II
Evolution, Verknüpfung mit U snRNAs in Spliceosom

Answer 23

reversibler Mechanismus
Introns können in fremde RNA und sogar in DNA springen
haben oft ORF für RT –> sind eigentlich Transposons, entgehen als Intron dem Selektionsdruck
unsere Introns also aus Transposons hervorgegangen
RNA Bestandteil der snRNPs zusammen bilden zentrales Rad der Gruppe II Introns;
haben in letzter Domäne ebenfalls ungepaarten Branch point

Question 24

rein protein katalysierte Spleißreaktion

Answer 24

bei tRNA
im Anticodon Arm ein Intron, 5’ und 3’ Spice site, durch spezifische Endonuclease TSEN geschnitten
TSEN: tRNA Splicing Endonuclease
es entsteht 2’,3’-Cyclophosphat am ehemaligen 3’ und 5’Hydroxylgruppe
RtcB Ligase kann beides fusionieren

Question 25

RNA Editing

Answer 25

Änderung in der Nukleotidsequenz einer RNA, nachdem diese transkribiert wurde.
Dabei werden Eigenschaften und Funktion des Genproduktes (RNA, Protein) gegenüber der codierenden DNA-Sequenz verändert.
RNA Editing kann aus Nukleotid-Insertionen, -Deletionen oder Basen-Änderungen bestehen.“
Beinhaltet nicht Splicing!

Question 26

mtDNA in Kinetoplasten

Answer 26

maxi und mini circles in Mitochondrien
ursprünglich keine mtDNA Gene gefunden
aber auf Maxi circles ORF: MURFs : Mitochondrial Unidentified Reading Frames
aber auf cDNA normale Mitochondriale Sequenzen, erst als Cryptogene bezeichnet
in translatierte MURF wurden viele Us eingefügt
GU-Basenpaaren in tRNA möglich -> komplementäre Bereich in Minicircles gefunden = gRNAs

Question 27

minicircles

Answer 27

codieren für gRNAs (40-80nt)
Information, wo Us eingebaut oder herausgeschnitten werden
an 5’ Ende konstante Region= Anker; sead Seqeuenz, danach editing machinerie

Question 28

am RNA Editing beteiligte ENzymaktivitäten

Answer 28

RNA Endonuclease
RNA Helicase, die perfekt gepaarte gRNA abtrennt (alpha-helix sonst zu stabil)
TUTase (Terminal Uridylyl Transferase)
RNA 3’-5’ Exonuclease
RNA Ligase
Editing immer von 5’ in 3’ Ende

Question 29

Desaminierung

Answer 29

APOBEC desaminiert Cytodin zu Uridin
ADAR desaminiert Adenosin zu INosin

Question 30

APOBEC

Answer 30

editiert eine Position in einem Transkript
Apolipoprotein B mRNA Editing Enzyme Catalytic Polypeptide
für Apolipoprotein B
im Exon Gln
aus Glu wird in Leber nix, im Darm Stoppcodon
C-> U Editing
spezifität durch Hilfsfaktor: ACF, spezielle Erkennungssequenz auf RNA (Mooring Sequenz) binden katalytische Einheit, definiert Abstand zu editiertem C

Question 31

ADAR

Answer 31

Adenosine Deaminase Acting on RNA
Inosin wie Guanosin gelesen
im Glutamat Rezeptor, der als Ca-Kanal fungiert
in Helix 2 des Kanals Ligand binding site
ohne Editing: Gln; lässt auch Ca, und Na durch
mit Editing: Arginin: lässt nur Na und K durch
Selektivität geändert
in einzelenen Gehirnregionen > 99% R
keine Editing: schwere Schäden in Gehinrentwicklung

Question 32

Editing in tRNAs

Answer 32

an quasi allen Stellen möglich:
an 5’ Ende, an 3’Ende
Intern
Basenaustasuch
Basenkonversion durch Desaminierung

Question 33

RNA Editing in Mitochondrien von Beuteltieren

Answer 33

im Genom fehlt tRNA für Asp, aber 2 für Glycin
ein Gly tRNAs an mittlerer Position editiert, erkennt Asp
Identitätswechsel durch RNA Editing
Enzym und Regulation unbekannt

Question 34

Zusammenfassung RNA Editing

Answer 34

Posttrankritpionale Änderung der RNA Sequenz
NICHT: Splicing, Cappping, Polyadenylierung, Basenmodifikation
Erhöhung der Funktionsvielfalt
Einzelne Positionen bzw bis zu 70% einer mRNA editierbar
Vorkommen: mRNA (Exon und INtron), rRNA, tRNA
mechanistisch uneinheitlich: Insertion, Deletion, Desaminierung, Aminierung, mit/ohne gRNAs

Question 35

snRNPs

Answer 35

hier nur RNA katalytisch aktiv, z.B. U4, U5, U6
der Großteil des Spliceosoms allerdings aus Proteinen ohne RNA Untereinheit
small nuclear ribonucleoproteins

Question 36

ATAC Introns - Spliceosom

Answer 36

auch snRNPs
an 5’ spice site bindet U11 und am branch point U12
U5 gleich, aber spezeille U4 und U6
Ablauf sonst identisch, nur andere Intronsequenz erkannt

Question 37

wie binden Spleißfaktoren an RNA

Answer 37

U1 hat RNA Untereinehit, die komplementär zu GT der RNA ist, folgende Nukleotide nur leicht konserivert
BBP erkennt Sequenz ohne RNA Untereinheit, sondern mit DNA-Bindedomänen, wird ja dann durch U2 snRNP ersetzt, das Basenpaaren kann nur icht mit A des Branch point, das wird ja schließlich rausgestülpt
U6 und U2 können Basenpaaren, U6 bindet nämlich 5’ Splice Cite und U2 Branch cite -> Interaktion

Question 38

Sm cite

Answer 38

sorgen dafür, dass Proteine sequenzspezifisch interagieren
weniger konservierte Sequenzen in snRNPs

Question 39

Voraussetzung für universelles Splicing

Answer 39

vom Intron werden nur kleine Bereiche erkannt

Question 40

Gruppe II Introns Mechanismus

Answer 40

1. Umesterung: “’ OH des branch point A aktiviert, an 1. Grenze angreifend; Lariat entsteht; dann 3’OH des 1. Exon Angriff an 2. Splice site
   Exons ligiert; Intron wieder als Lasso/Lariat
   =Vorläufer des Spliceosom