Vorlesung 12

Question 1

RBS in Prokaryoten

Answer 1

vor jedem Startcodon in Eukaryoten
Ribosomenbindungsstelle
Purinreicher Stretch als Konsensus Sequenz
16S rRNA komplementär zu RBS
danach erstes AUG verwendet, Leseraster festgelegt
= Shine-Dalgarno-Sequenz

Question 2

RBS in Eukaryoten

Answer 2

Ribosom lagerst sich erstmal an Cap an
Ribosom zieht mRNA dann durch bis zum 1. AUG
AUG muss in Kozak-Sequenz eingelagert sein
sehr GC-reich
Kozak-Sequenz legt Leseraster fest

Question 3

Akzeptor-Arm

Answer 3

hier bindet Aminosäure
endet auf CCA
3’ Ende der tRNA

Question 4

D-Loop

Answer 4

enthält Dihydrouridin = gesättigter Ring
Basen nicht mehr planar, sondern in Sesselkonformation
bei psychrophilen (Kälteliebenden) Organismen DH-Uridin häufiger, damit flexibler

Question 5

TpsiC Arm

Answer 5

Pseudoruridin
zusätzliche H-Brücken
keine N-glycosidische Bindung
macht RNA starrer

Question 6

tertiäre Basenpaarung

Answer 6

stabilisieren Struktur der tRNA
9 Stk
bewirkt L-förmige Struktur mit Akzeoptor und Anticodon-Arm an den Enden

Question 7

Beladen der tRNA

Answer 7

=Aminoacylierung
1. Aktivierung der Aminosäure: Carbpoxygruppe der Aminosäure greift an alpha-Phosphat von ATP an -> Adenylierte Aminosäure + PP
2. Übertragung der aktivierten Aminosäure auf tRNA: Adynlierte Aminosäure wird am Carboxy-C von 3’ OH der tRNA angegriffen -> beladene tRNA + AMP

Question 8

Genauigkeit der Aminoacylierung

Answer 8

mehr tRNAs als AS
hohe Genauigkeit bei Aminoacylierung
Fehllerrate: 1,6*10^-5
Beladung der tRNA bestimmt Genauigkeit der Translation

Question 9

Aminoacyl-tRNA-Synthetasen - wie Erkennung und Genauigkeit

Answer 9

haben Identitätselemente, wirken additiv
z.B. ungepaarte diskriminierende Base (4. vom 3’ Ende aus) oder Anticodon Stamm
Gibt auch Anti-Determinanten auf tRNA, die bestimmte Aminosäuren ausschließen
Synthetasen interagieren mit Identiätselementen und normalem Zucker-P-Rückgrat auf tRNA

Question 10

Aminoacyl-tRNA-Synthetasen: Anzahl, Einteilung

Answer 10

20 Stk (für jede AS)
Klasse I: Beladung 2’ OH der tRNA
Klasse II: Beladung des 3’ OH der tRNA
keine Systematik
binden beide an terminales 3’A
gibt regen Austausch zwischen 3’ OH und 2’ OH

Question 11

Erkennung richtige AS in der Translation

Answer 11

“diskriminatorische AS”
nur eine AS passt in aktives Zentrum der Synthetase
Aminoacylierungsfehlerrate: ca. 10^-5
nicht nur über Großenkomplementarität, sondern auch Korrekturmechanismus (Editing)

Question 12

“Editing”

Answer 12

pre-/post-Transfer Editing
pre: falsche AS aktiviert, wird korrigiert und wieder desaktiviert
post: Falsche AS auf tRNA übertragen, noch auf Synthetase; AS wird wieder abgespalten

Question 13

Editing Domänen in Aminoacyl-tRNA-Synthetasen

Answer 13

evolutionär haben die meisten Synthetasen eine Editin Domäne erworben
inkorrekte Aminosäure wird an Synthesis site an tRNA angehängt, hat aber höhere Affinität zu Editing site und wird da wieder hydrolysiert

Question 14

Vergleich Translation Pro/Eukaryoten

Answer 14

Eukaryoten größere Ribosomen
bei beiden aus großer und kleiner Untereinheit
bei beiden gibt es mehr Proteine als RNA Bestandteile, aber RNA macht einen größeren Teil der Masse aus
Peptidyltransferasezentrum nur aus RNA = Ribozym

Question 15

Aufbau prokary Ribosom

Answer 15

70S Ribosom, aus 50S und 30 S UE

Question 16

Aufbau eukaryot. Ribosom

Answer 16

80S Ribosom aus 40 S und 60 S UE

Question 17

Ablauf Translation, Allgemein und APE sites

Answer 17

kleine ribosomale Untereinheit bindet an mRNA, Initiatoin, große Untereinheit bindet, Elongation mit neuen beladenen tRNAs, Freisetzung Ribosom
A-Site: hier bindet Aminoacyl-tRNA
P-Site: Bindungsstelle der Peptidyl-tRNA
E-Site: Exit-Site, Entladene tRNA rausgedrängt
mRNA Entry channel und mRNA exit channel (Freistzen des synthetisierten Proteins)
tRNAs wandern A-P-E

Question 18

Initiation der Translation bei Prokaryoten

Answer 18

UE des Ribosoms getrennt
IF3 bindet an E site in kl UE
IF1 und IF2 und GTP in A site rekrutiert
mRNA und beladene fMet-tNRA binden in P
nur bei Initiation kommt erste tRNA in P site

Question 19

Met-tRNA

Answer 19

erkennen beide das Anticodon UAC
gibt aber 2 tRNAs: Elongaot-tRNA und Initiator-tRNA
Gemeinsamkeiten: werden beide von Methionyl-tRNA-Synthetase erkannt
Unterschiede: Elongator-tRNA wird von EF-Tu erkannt; Initator-tRNA von IF2 und Transformylase, Initiator-tRNA beladen mit Met und zusätzliche Formylierung;

Identitätselemente: am Akzeptorstem nicht.paarende Basen
am Akzeptorstamm 3 aufeinanderfolgende CG bp
A-U im D-Arm
sind Erkennungsmerkmale für Transformylase und IF2

Question 20

Initiator-tRNAfMet

Answer 20

zusätzliche Identitätselemente
am Akzeptorstamm eine nicht-paarende Base
am Anticodon-Stamm 3 aufeinanderfolgende C-G-Paarungen
im D-Arm A-U-Paarung
bilden Erkennungsmerkmale für Transformylase und IF2

Question 21

Formylierung von Met

Answer 21

N-Formylierung
Grund unklar, nur bei prokaryoten
imitiert wsl eine peptidbindung
mit Transformylase und Formyl-THF
erst nach der Bindung von Met an tRNA

Question 22

Initiation 2/2 Prokaryoten

Answer 22

IF 3 diffundiert aus E site ab
große UE bindet
GTP hydrolysiert, IF 1&2, GDP und P diffundieren ab
in P site Initator-tRNA gebunden, andere sites frei; Warten auf tRNAs

Question 23

Startcodons

Answer 23

neben AUG weitere Startcodons
codieren als Startcodon alle für Met, intern dann auch Val und Leu möglich

zeigt, dass Initiator-tRNA begrenzt Fehlpaarungen an erster Stelle des Codons tolerieren kann

Question 24

Initiation Eukaryoten

Answer 24

deutlich komplexer: mehr Faktoren beteiligt, keine Formylierung
beladene Initiator tRNA bindet auch in P site -> 43 S Präinitiationskomplex
verschiedene Faktoren in A und E site
Präinitiationskomplex bindet an Cap Struktur; Ribosom zieht RNA durch und zieht sie bis Kozak-Sequenz durch; tRNA paart danach mit Startcodon
nach Binden weiterer Faktoren lagert sich dann vollstängies Ribosom zusammen; auch hier weider Met in P site und der Rest leer

Question 25

Disassembling in Initiation der Translation in Eukaryoten

Answer 25

alle IF diffundieren ab
nur noch tRNA
andere IF erst abgelöst, wenn 60 UE assembliert

Question 26

optimierte Initation bei Eukaryoten

Answer 26

ringförmig tRNA
IF an 5’CAP interagieren mit Poly A Binding Proteinen an 3’
auseinanderfallendes Ribosom am Stoppcodon kann bald wieder am Anfang paaren

Question 27

IRES

Answer 27

Cap unabhängige Initiation
Internal Ribosomal Entry Site
viele hairpins stromaufwärts von AUG
binden IF und kleine UE an IRES und damit Startcodon
auch bei Eukaryoten
in mRNAs ohne Kappenstruktur
in Picorna-Viren

Question 28

Elongation bei Eukaryoten

Answer 28

beladene tRNA bindet mit EF-Tu an A site
EF TU ist GTPase und hat GTP gebunden
GTP wird hydrolysiert und EF-TU-GDP freigesetzt
EF-Ts bewirkt GDP Freisetzung
GTP bewirkt EF-Ts Freisetzung
EF-G-GTP bewirkt Elongation in P site, tRNAs werden dabei eine Stelle weiter geschoben
A site wieder freigemacht
EF-G-GDP und EF-Tu-GTP ähneln in ihrer Struktur tRNA, Molecular Mimicry, deshalb binden die so gut in A-site

Question 29

Kontrollmechanismen der Translation

Answer 29

Fehlerrate: 10^-3 bis 10^-4
3 Mechanismen
Codon-Anticodon-Basenpaarung allein reicht nicht
1. 16S rRNA Interaktion: 16S rRNA: nur bei korrektuer Basenpaarung kann 16S rRNA an Helix andocken und tertiäre Interaktionen bilden
2. GTPase Aktivität von EF-Tu: kinetische Selektivität; wenn tRNA-EF-Tu-GTP nicht an Factor Binding Center binden kann, dann keine GTP hydrolase und tRNA dissoziiert wieder ab
3. Accomodation: tRNA muss angepasst werden; tRNA muss sich drehen in A site, bei unkorrekter Basenpaarung geht das nicht und tRNA dissoziiert wieder ab

Question 30

Termination der Translation

Answer 30

Release Faktores benötigt
2 Klassen
Klasse I: erkennt Stop Odons
KLasse II: stimiliert DIssoziation Klasse I
bei Prokaryoten und Eukaryoten ähnliche Faktoren, nicht gleich

Question 31

Ribosome Recycling Factor

Answer 31

tRNA ähnliche Struktur= tRNA Mimikry
RRF bindet in A site; EF-G-GTP bindet in A Site
EF-G bewirkt GTP Hydrolase
dadurch tRNAs in P und E site entlassen
IF3 bewirkt auflösen des Ribosoms und Ablösen von EF-G und RRF und mRNA

Question 32

Puromycin

Answer 32

Aminoacyl-tRNA-Analogon
kann statt Tyrosyl-tRNA in A site reindiffundieren
sorgt dafür, dass Peptidkette in P site auf Puromycin übertragen wird, Amid statt Esterbindung
Proteinbiosynthese kommt zum Erliegen
leitet verfrühte Termination ein

Question 33

Supressor-tRNA

Answer 33

tRNAs, die ein Stoppcodon, das duch Mutation unterstanden ist, unterdrücken können
Mutation im Anticodon
Anticodon kann wieder mit Stopcodon interagieren
führt zu read through
andere Supressor-tRNAs können +1Frameshift ausgleichen, indem sie Antocodon aus 4 Basen haben

Question 34

Recycling von EF-Tu

Answer 34

beladene tRNA ans Ribosom gebracht, GTP Hydrolyse, EF-Tu-GDP löst sich von tRNA
inaktiver EF-Tu-GDP von EF-Ts erkannt, GDP abgelöst
EF-Tu-EF-Ts bindet GTP, dadurch EF-Ts dissoziierend
EF-Tu-GTP kann neue Aminoacyl-tRNA binden

Question 35

Wobble Hypothese

Answer 35

genetischer Code ist degeneriert, 3. Base des Codons nicht so relevant
entspricht 1. Base des Anticodons auf tRNA in 5’ Ende
tRNA kann mehrere Codons erkennen

Question 36

Kurze Zusammenfassung: Geringer Fehlerrate der Translation

Answer 36

Codon-Anticodon-Paarung
16S rRNA Interaktion
GTPase Aktivität von EF-Tu
Accomodation: Anpassen der tRNA

Question 37

aminoglycosidische Antibiotika

Answer 37

Struptomycin, Neomycin, Tobramycin, etc
irreversible INteraktion mit Proteinen/rRNA der 30S UE:
Codon Misreading
Inhibition der Peptidyltransferase
lagern sich nach AUG ein und bewirken, dass jedes Anticodon paaren kann

Question 38

Ricin

Answer 38

Protein-Toxin in Eukaryoten
A-B-Toxin: A-Kette Toxin, B-Kette nur Transporter, Glycoprotein für Aufnahme in Zelle
A ist spezifische N-Glycosidase für 28S rRNA
Ribosom wird irreversibel inaktiviert
Abspaltung eines Adenins der 28S RNA der Ribosomen (Depurinierung)
Bildung des Initiationskomplexes stark verlangsamt; auch Bindung von Elongationsfaktoren unterbrochen