Vd. Secuenciación de ADN Flashcards
La secuenciación de ADN fue posible gracias a la introducción de:
Métodos electroforéticos
Conocimiento de la química de los nucleótidos
metabolismo del ADN
V o F, en la secuenciación del ADN en un principio se usó marca fluorescente y posteriormente radiactiva:
Falso, primero fue la radioactiva y luego la fluorescente
Son los 4 tipos de métodos de secuenciación del ADN:
Químico
Enzimático
Siguiente generación
Secuenciación por bisulfito
Método químico de la secuenciación de ADN:
Maxam y Gilbert (radioactividad)
Son los métodos enzimáticos de la secuenciación del ADN:
Sanger (radioactividad)
Automatizada (variación de sangrer usando fluorescencia)
Son los métodos de siguiente generación de la secuenciación del ADN:
454-Pirosecuenciación
Ilumina
Son las 3 etapas del método de Maxam y Gilbert:
Marcaje del ADN
Hidrólisis química específica del ADN
Análisis de los productos
El marcaje del ADN en el método de Maxam y Gilbert consiste en:
Marcar el extremo 5´de cada hebra
¿Qué es lo más común para marcar el extremo 5´de cada hebra en el Método de Maxam y Gilbert?
Polinucleótido cinasa
ATP radiactivo
La polinucleótido cinasa que es usada como nucleasa en el marcaje de ADN en el método de Maxam y Gilbert, in vitro esta actúa como:
Une nucleótidos en vez de separarlos
La hidrólisis química específica del ADN del método de________________es para obtener fragmentos de ADN de hebra____________ marcados, de longitud ___________y que terminen en un____________conocido:
Maxam y Gilbert
sencilla
variable
nucleótido
En la hidrólisis química específica del ADN del método de Maxam y Gilbert, la muestra se divide en ____________y cada una recibe____________diferente con el fin de eliminar separadamente las bases____________y___________
4 alícuotas
Tratamiento químico
Púricas (A y G)
Pirimidínicas (T y C)
Agentes químicos usados en la hidrólisis química específica del ADN del método de Maxam y Gilbert para dividir las muestras:
Dimetil sulfato
Ácido fórmico-dimetilsulfato-piperidina
Hidrazina-piperidina
Hidrazina-1-5M NaCl-piperidina
Agente químicos usado en la hidrólisis química específica del ADN que corta en la G:
Dimetil sulfato
Agente químicos usado en la hidrólisis química específica del ADN que corta en A o G:
Ácido fórmico-dimetilsulfato-piperidina
Agente químicos usado en la hidrólisis química específica del ADN que corta en C o T:
Hidrazina-piperidina
Agente químicos usado en la hidrólisis química específica del ADN que corta en C:
Hidrazina-1-5M NaCl-piperidina
En el análisis de los productos del método de Maxam y Gilbert las ____________ obtenidas se analizan por_______________:
4 mezclas
Electroforesis
Método que se basa en el mecanismo normal de la replicación
Método de Sangers
El método de Sanger, la DNA polimerasa extiende la cadena de DNA debiendo estar presente el ____________ en el _________ de la desoxirribosa
Grupo hidroxilo
Carbono 3’
Los_________ carecen del _________ necesario para que se lleve a cabo la polimerización
ddNTPs
Grupo 3’ hidroxilo
¿Qué sucede en la polimerización en el método de Sanger al agregar ddNTPs a la cadena creciente?
Se interrumpe y forma fragmentos de diferente logitud
La polimerasa empleada en el método de Sanger carece de esta actividad…
3’-5’ exonucleasa de corrección
En este método enzimático de la secuenciación del ADN los ddNTPs están marcados con fluorescencia
Secuenciación automatizada
¿Qué tipo de electroforesis se usa en la separación de fragmentos de DNA en la secuenciación automatizada?
Electroforesis capilar
¿En qué dirección se encuentran los fragmentos más cortos en la secuenciación automatizada?
Hacia 5’
¿Cuál es el fluorocromo empleado para A y qué emisión da?
JOE–> Verde
¿Cuál es el fluorocromo empleado para C y qué emisión da?
FAM–> Azul
¿Cuál es el fluorocromo empleado para G y qué emisión da?
TAMRA–> Amarillo
¿Cuál es el fluorocromo empleado para T y qué emisión da?
ROX–> Rojo
¿Cuáles flourocromos estan derivados de fluoresceína?
JOE y FAM
¿Cuáles fluorocromos están derivados de rodamina?
TAMRA y ROX
Cada ddNTP está marcado con un _________ único
Flourocromo
V o F. La reacción de ddNTPs marcados se hace en diferentes tubos
Falso, solo en uno
Gráfico realizado con los resultados de un análisis por electroforesis
Electroferograma
V o F. La detección de un polimorfismo o mutación puntual se hace a través de un electroferograma
Verdadero
Una reacción de secuenciación emplea un solo ________ o _________, y permite obtener la ________ de una de las cadenas
Primer
Cebador
Secuencia
Método de reacción de DNA en tiempo real basado en la liberación de pirofosfatos
454-pirosecuenciación
V o F. El método de Sangers permite secuenciar un genoma humano completo en un solo día o el de una bacteria en unas horas
Falso, es la 454-pirosecueciación
V o F. La 454-pirosecuenciación requiere correr los fragmentos en un gel, marcadores fluorescentes y el uso de ddNTPs
Falso
¿Al rededor de cuantas pares de bases la 454-pirosecuenciación puede fragmentar el genoma?
300-800pb
Oligonucleótidos que se ligan en los extremos de los fragmentos de la 454-pirosecuenciación
A y B
¿Cuál es la función del oligonucleótido B?
Amplificación y secuenciación, y permite hibridar un primer o cebador universal
¿Cuál es la función del oligonucleótido A?
Para que la secuencia se una a una micro esfera
V o F. En la preparación de la micromatriz, las microesferas se depositan en una microcelda, siendo una esfera por pozo
Verdadero
¿Cuáles son las 4 enzimas necesarias para la pirosecuenciación?
DNA polimerasa
Sulfirilasa y su sustrato
Luciferasa y su sustrato
Apirasa
Enzima para la pirosecuenciación que incorpora dNTPs liberando PPi
DNA polimerasa
Enzima para la pirosecuenciación que sintetiza ATP a partir de PPi
Sulfirilasa
Enzima para la pirosecuenciación que da una emisión de luz a partir de ATP
Luciferasa
Enzima para la pirosecuenciación que degrada los dNTPs no incorporados
Apirasa
Método de secuenciación donde usa los nucleótidos terminadores marcados bloqueados reversiblemente en el 3’ OH
Ilumina
¿A través de qué reacciones se retira el bloqueo en el método de Ilumina?
Químicas o fotolíticamente
¿Cuándo se retira el bloqueo en el método Ilumina?
Después de haber incorporado un nucleótido a la cadena y registrar la señal fluorescente
Método de secuenciación que detecta patrones de metilación aberrantes
Secuenciación por bisulfito
El tratamiento con bisulfito convierte la _________ en ___________ pero no afecta a la _______________
Citosina
Uracilo
5-metilcitosina
V o F. El tratamiento con bisulfito es previo a la secuenciación
Verdadero
¿En qué muestras por secuenciación por bisulfito se pueden dar falsos positivos?
Muestras con conversión incompletas y en RNA
¿En qué tipos de análisis es útil la secuenciación por bisulfito?
Muestras forenses
Células madres
Cáncer
V o F. En la secuenciación con bisulfito, las citocinas se metilan por este y forman uracilo
Verdadero
