Va. Extracción, cuantificación y purificación de ácidos nucleicos Flashcards
La cuantificación y determinación de pureza de los ácidos nucleicos está dada por:
Espectrofotómetro
La purificación de los ácidos nucleicos está dada por:
Cromatografía de afinidad
Electroforesis
Tipos de electroforesis:
Convencional en gel
Campo pulsado
Capilar
Es el primer paso en la tecnología del ADN recombinante:
Aislamiento del ADN
¿Dónde se halla el ADN genómico de la célula eucariota?
Núcleo
El ADN genómico se halla asociado a:
Proteínas
¿Dónde se halla el ADN plasmídico?
Procariotas
¿Cuál es la función del buffer de lisis en la extracción de ADN genómico?
Mantener pH
Romper membranas
Desnaturaliza y degrada proteínas
Son los 7 pasos para la extracción de ADN genómico:
- Muestra de células
- Añadir buffer de lisis
- Precipitar proteínas
- Precipitar ADN
- Lavado
- Resuspender en agua libre nucleasas
- Cuantificar y determinar pureza
En la extracción del ADN genómico, este se precipita con:
Alcohol frío
Concentraciones elevadas de sal
Es el método más común para separar las células mononucleares de sangre periférica (CMSP):
Gradiente de Ficoll que separa por diferencias de gradientes
Son los componentes que forman al buffer de lisis:
Tris-HCL: 50 mM
SDS: 1%
Proteasas: proteína K (2mg/ml)
¿A qué pH se debe de hallar el Tris-HCL del buffer de lisis?
8.0
¿Cuál es la función del Tris-HCL en el buffer de lisis?
Mantener pH para que el ADN mantenga su carga negativa
Detergente aniónico del buffer de lisis para romper las membranas y se libere el ADN:
SDS 1%
¿Cuál es la función del SDS en el buffer de lisis?
Desnaturaliza proteínas y sean accesibles a proteasas
La proteinasa K del buffer de lisis se aisló de:
Hongo Tritirachium album
¿En qué condiciones se halla activa la proteinasa K del buffer de lisis?
Bajo condiciones desnaturalizantes
V o F, la proteinasa K es una serina proteasa:
Verdadero
Son las 3 funciones de la proteinasa K del buffer de lisis:
Activa contra proteínas nativas y desnaturalizadas
Inactiva ARNasas ADNasas
Destruyen proteínas que crean un enlace con el ADN
¿Qué proteínas que crean un enlace con el ADN, pueden ser destruidas por la proteinasa K?
Polimerasas
Factores de transcripción
Histonas
La proteinasa K del buffer de lisis aumenta:
-Pureza de ADN y que se contamine menos por proteínas
-Calidad/cantidad de ADN no degradado
¿Con qué soluciones se puede precipitar las proteínas para la extracción de ADN genómico?
Soluciones de acetona
¿Qué queda en el sobrenadante cuando se centrifugan proteínas para poder precipitarlas?
Ácido nucleico
Al precipitar ADN por sales (NaCl), estos iones se encargan de:
Neutralizar cargas negativas de los grupos P
V o F, al precipitar ADN con sales, las moléculas se repelen:
Falso, se juntan
Al precipitar el ADN con sales, disminuye_______________ y así se facilita____________ al añadir__________:
Solubilidad del ADN
Precipitar el ADN
Alcohol
Son características del alcohol frío (etanol) que precipita el ADN:
Miscible con agua
Menos polar que el agua
V o F, el ADN es soluble en etanol:
Falso, no lo es
¿Quién es más polar del ADN y ARN en alcohol frío (etanol)?
ARN, por lo tanto no precipita
Función de la T° al precipitar el ADN:
Al disminuirse la T° se insolubiliza más el ADN
Función del etanol al 75% en los lavados:
Remueve sales e impurezas no disueltas en el ADN
La solubilización del ADN en agua libre de nucleasas se da en este paso de la extracción del ADN genómico:
- Resuspensión del ADN
Los espectros de absorbancia de á. nucleicos y proteínas muestran estos niveles máximos:
260nm: á. nucleicos
280nm: proteínas
El espectrofotómetro calcula la concentración de á. nucleicos en la solución con base a:
Absorbancia a 260 nm
Coeficiente que determina la pureza:
260/280
¿En qué paso de la extracción del ADN genómico se utilizan los espectros para calcular la concentración de ácidos nucleicos?
- Concentración y pureza
El método del Fenol-cloroformo en la extracción del ARN, tiene esta función similar al SDS en la extracción de ADN:
Romper membranas
Desnaturaliza proteínas
Libera ácidos nucleicos asociado a otras moléculas
En la extracción del ARN, la adición de más cloroformo provoca:
Separación de las fases
Entre el fenol y el cloroformo, ¿quién tiene mayor polaridad?
Fenol, el cloroformo es inmiscible en agua
El ADN al ser menos polar que el ARN, se queda entre estas dos fases:
Fase acuosa y fenólica junto con las proteínas
¿En qué fase el ARN se halla disuelto?
Fase acuosa
¿Qué tipo de alcohol se adiciona para poder precipitar el ARN y después centrifugarlo?
Alcohol frío (isopropanol)
Entre el isopropanol y el etanol, ¿cuál es más polar?
Etanol
Factores extrínsecos a la partícula que determinan su movilidad electroforética:
1.Concentración de agarosa
2. Voltaje que se aplica
3. Tiempo de corrida
4. T°
El polisacárido de Agarosa se halla formado por:
B-(1-4)-(3-6)-anhidro-L-galactosa
a-(1-3)-D-galactosa
La agarosa es soluble en agua y a temperaturas superiores a:
65°C
Concentración de agarosa:
0.5-4%
La movilidad_________al aumentar el % de agarosa:
Disminuye, pero se separa mejor
Cuando se aumenta el voltaje la movilidad__________ aunque puede no_____________la resolución:
Aumenta
incrementar
Voltaje típico por cada cm de gel
Aprox. 10V/cm de gel
Aproximadamente, ¿Cuánto mide un gel de agarosa y cuál es el voltaje adecuado para su tamaño?
100-130V y mide 10-15 cm
¿Qué voltaje genera una mejor resolución por cm de gel?
5V/cm de gel
V o F. A mayor tiempo de corrida menor resolución
Falso, es mayor la resolución
Al ______ la temperatura, la movilidad ______ como si hubiera ______ la concentración de agarosa
Incrementar
Aumenta
Disminuido
¿Qué le sucede al gel si la temperatura aumenta más de lo normal?
El gel puede fundirse, la temperatura se mantiene lo más bajo posible
Agentes que se usan para la visualización de los ácidos nucleicos por su florescencia
- Bromuro de etidio
- SYBR
¿Qué agente que se usa para la visualización de ácidos nucleicos se intercala entre las bases?
Bromuro de etidio
El bromuro de etidio absorbe de _________ a________ y emite fluorescencia de _______________
260-300nm
Rojo-naranja
V o F. El bromuro de etidio detecta hasta 3 ng
Falso, es más sensible, detecta 1 ng; el agente que si detecta 3ng es el SYBR
¿Qué agente es menos tóxico pero menos sensible?
SYBR
¿En qué situaciones se agrega el bromuro de etidio?
Agarosa o post corrida
Son mezclas de moléculas de diferente PM que sirven de referencia para el análisis cualitativo de las muestras analizadas
Marcadores de peso molecular
Los marcadores de peso molecular son una mezcla de estas moléculas…
Ácidos nucleicos
Ejemplos de marcadores de peso molecular
DNA de fagos o plásmidos digeridos por enzimas de restricción
¿A qué se refiere el análisis cualitativo en marcadores de peso molecular?
Determinar el PM en una banda específica
La EMSA mide el….
Análisis de retraso en gel
¿Cuál es el fundamento de la EMSA?
Está basada en la interacción de ácidos nucleicos y proteínas (las cuales tienen mayor PM)
V o F. La electroforesis en gel de campo pulsado, se usa para la separación de grandes fragmentos de ADN
Verdadero, hasta millones de bases
En este tipo de electroforesis las moléculas se reorientan por cambios periódicos en la dirección del cambio eléctrico
Electroforesis en gel de campo pulsado
Al aplicar E1 las cadenas de ADN se ____________ y ____________ en esa dirección
Estiran
Orientan
Al aplicar E2, perpendicular a E1, se obliga a las cadenas de ADN a ___________, _______________, y ___________ en una nueva dirección
Relajarse
Elongarse
Alinearse
En la electroforesis en gel de campo pulsado les toma_____________ tiempo reorientarse y exhiben ____________ movilidad
menor
mayor
¿Cuál es el ángulo de reorientación entre E1 y E2?
> 100°
¿Qué medios para evitar que el DNA se fragmente, se utilizan en la electroforesis de gel de campo pulsado?
Concentraciones de alta viscosidad y células completas
Previo al corrimiento electroforético en gel de campo pulsado, ¿Qué sucede con el ADN genómico?
Se digiere con enzimas de restricción
Cuando el ángulo alfa se incrementa, los campos eléctricos son…
Campos eléctricos no homogéneos
Cuando el ángulo alfa es constante, los campos eléctricos son…
Campos eléctricos homogéneos
¿Cuáles son los campos eléctricos no homogéneos?
PFGE
OFAGE
TAFE
¿Cuáles son los campos eléctricos homogéneos?
FIGE
CHEF: más usada
RGE
Cuanto _________ es el tamaño del ADN a separar, ___________ es la duración de los pulsos y __________ el voltage
mayor
mayor
menor
Electroforesis que es empleada en la secuenciación automatizada:
Electroforesis capilar
En la electroforesis capilar, se usan capilares de:
Sílice (SiO2) recubiertos de poliamidas
Campo eléctrico de la electroforesis capilar:
mayor a 100-500 V/cm
Tiempo que tarda en dar resultados la electroforesis capilar:
5-60 min
El ADN del gen discontinuo posee:
Intrones=mayor PM
El ADNc se corresponde a:
ARNm, que carece de intrones=menor PM
