Vc. PCR y sus variantes Flashcards
¿Quién propuso el PCR en 1993?
Kary Mullis
Método de amplificar selectivamente una secuencia deseada de ADN de copia única, que se encuentra en una mezcla de ADN sin purificación
PCR
Función de los primer o cebadores en la PCR
Logran amplificar una zona de DNA
¿Qué tipos de DNA polimerasa participa en la PCR?
DNA polimerasa termoestable
¿Cuál es la función de la DNA polimerasa termoestable en la PCR?
Sintetiza la hebra complementaria incorporando dNTPs libres del medio de reacción
La ADN polimerasa termoestable fue dirigida inicialmente por…
Primers o cebadores
¿Cómo se componen los ciclos controlados de temperatura de la PCR?
Desnaturalización
Alineamiento
Elongación
¿Cuál es la temperatura usual para la desnaturalización en la PCR?
94 o 95°
¿Qué temperaturas en la PCR evitan que se renaturalice el DNA?
> 90°
¿Para qué se aumenta la temperatura?
Romper puentes de hidrogeno
Los primers o cebadores son ___________ específicos de ___________nt, cuya secuencia es ___________ a los extremos del fragmento que se desea ____________
Oligonucleótidos
20-23nt
Complementaria
Amplificar
¿Qué sucede con los primers cuando se disminuye la temperatura en la PCR?
Se hibridan especificamente en los extremos de la secuencia blanco
Los primers dirigen a la______________ que sintetiza la hebra _____________ incorporando nucleótidos libres del medio de reacción
DNA polimeras
Complementaria
Temperatura en la cual la polimerasa empieza a agregar nucleótidos en la PCR
72°
Al final del primer ciclo se obtiene____________ moléculas de DNA ______________ parcial que contiene la secuencia blanco
2
doble cadena
V o F. Solo el ADN que contiene la secuencia blanco es copiado
Verdadero
La polimerasa solo puede copiar moléculas que contienen…
Cebador único
Al final del segundo ciclo se obtienen _____hebras de DNA
8
Maquina de PCR o ____________, tiene la capacidad de mantener cambios de __________ cíclicos de forma precisa
Termociclador
Temperatura
Son las 3 fases de una PCR
Exponencial
Lineal
Plateau
¿En qué momento pasa la fase exponencial en ser fase lineal?
Cuando se empieza a agotar el número de cadenas (Ya no se amplifica)
V o F. Al haber una cantidad excesiva de copias de DNA molde, se inhibe la reacción
Verdadero
Hasta que punto en el PCR la amplificación se detiene
Los componentes de la reacción se agotan (Primers)
Fase del PCR en la que la amplificación se detiene
Fase plateau
V o F. En la PCR para detectar el genoma de un patógeno, el tamaño del amplificado (producto de PCR) se conoce de forma exacta su secuencia y el número de pares de bases que los primers están flanqueando
Verdadero
Son las 7 variantes del PCR
1- Con adaptadores
2- Inversa
3- Mutagénesis dirigida
4- RT-PCR
5- Tiempo real (PCR cuantitativa-qPCR)
6- RT-qPCR
7- Múltiplex
Variante de PCR donde se amplifica una región de ADN de secuencia desconocida
PCR con adaptadores
En la PCR con adaptadores se unen_________a los fragmentos de restricción de extremos____________:
Adaptadores
Cohesivos
Tipo de PCR que amplifica secuencias desconocidas con la condición de que se encuentren al lado de una secuencia de ADN sí conocida:
PCR Inversa
La mutagénesis dirigida se refiere a una amplia variedad de técnicas____________ que modifican la secuencia______________________:
In vitro
Silvestre
V o F, en la mutagénesis dirigida se pueden cambiar de una a tres bases en un segmento de ADN determinado sintetizando primers de PCR que lleven esos cambios:
Verdadero
Tipo de PCR que emplea dos enzimas polimerasas:
RT-PCR
Tipos de polimerasas que emplea la RT-PCR:
ADN polimerasa RNA dependiente (retrotranscriptasa)
ADN polimerasa ADN dependiente
Polimerasa de la RT-PCR que sintetiza cDNA a partir de ARNm:
ADN polimerasa RNA dependiente (retrotranscriptasa)
Polimerasa de la RT-PCR que amplifica el cDNA por PCR:
ADN polimerasa ADN dependiente
Los clones de cDNA contienen secuencias__________________ que son _________________:
Codificantes
Discontinuas
La PCR Tiempo real también se conoce como:
PCR cuantitativa (qPCR)
La PCR Tiempo real________________y simultáneamente_____________de forma absoluta el producto específico:
Amplifica
cuantifica
En la PCR Tiempo Real, el fluoróforo emite fluorescencia en función a:
Abundancia del producto de amplificación
En la PCR Tiempo Real, la medición de la _________________ se realiza luego de cada ____________ de amplificación:
Fluorescencia
Ciclo
Número de ciclos requeridos para que la fluorescencia específica sobrepase la fluorescencia de fondo inespecífica:
Ct (cycle threshold)
La ct es inversamente proporcional a:
Cantidad de ADN blanco inicial
Tipos de fluorescencia usadas en la PCR Tiempo real:
- SYBR green
- Sondas TaqMan
V o F, el SYBR green es un agente intercalante:
Falso, se asocia a la molécula de ADN
Al interactuar la SYBR green con la molécula de ADN, presenta un pico de absorción de________________y uno de emisión de_____________________:
498 nm
522 nm
¿En qué se basan las sondas Taq Man?
Actividad 5´-3´exonucleasa de la polimerasa
La fluorescencia resultante de la acumulación del producto se mide durante esta fase de la PCR:
Exponencial
PCR en la que se amplifican más de una secuencia en una misma reacción:
PCR Múltiplex
La PCR múltiplex emplea 2 o más pares de ___________________ en un único _____________ con el fin de amplificar simultáneamente múltiples_________________:
Primers
Tubo de reacción
Segmentos de ADN
¿Qué sucede con el cDNA después de obtenerse a partir de ARNm por la DNA polimerasa RNA dependiente?
Se amplifica por PCR cuantitativa
