SP-HC 3: Alberts h9 (Microscopy)

Question 1

Onder welke grootte kan een lichtmicroscoop niet in detail kijken?

Answer 1

< 200 nm

Question 2

Voordeel lichtmicroscoop tov elektronenmicroscoop

Answer 2

Met de lichtmicroscoop kan je levende cellen bekijken

Question 3

Hoe noemen we lichtmicroscopie met wit licht volledige transmissie?

Answer 3

Brightfield

Question 4

Met welke kleurstoffen worden delen van de cel gekleurd (toebrengen contrast)? Wat wordt door DAPI gekleurd?

Answer 4

Histologische kleurstoffen. DAPI kleurt DNA.

Question 5

Nadeel van de oude kleurstoffen

Answer 5

Je moet het celmembraan openmaken voor toebrengen > cel gaat dood

Question 6

Blauw licht heeft een …. energie dan rood licht

Answer 6

Hogere energie (lagere golflengte)

Question 7

Waarom kun je een blauwe kleurstof niet aan neuronen toevoegen?

Answer 7

Te hoge energie

Question 8

De oude kleurstoffen doen wel/niet aan lichtemissie

Answer 8

Niet, ze absorberen alleen licht als het erop wordt geschenen

Question 9

Enhancing contrast en dimregio

Answer 9

Het amplificeren van de golven als ze in fase zijn.
De dimregio is de plek waar twee golven elkaar uitdoven.

Question 10

Differential interference

Answer 10

Absorberen en doorlaten van lichtgolven van een bepaald contrast

Question 11

Dark field microscopy

Answer 11

Alleen lichtgolven (schuin onder geschoten), die onder een hoek binnenkomen en de cel raakt wordt afgebogen naar de detector, en bij de dikke delen van de cel gebeurt dat meer.
Dunne delen vd cel: zwart en de dikke delen grijs

Question 12

Phase contrast (DIC microscopy)

Answer 12

Veel vertraging van de lichtbundels bij de dikke delen waardoor de golven uit fase raken en een dimregio vormen > hele dichte/condense organellen worden donker afgebeeld.

Question 13

Formule voor resolutie

Answer 13

Resolution = (0.61 * λ) / (n * sin(θ))

Question 14

Een kleinere resolutie betekent: meer of minder detail

Answer 14

Dat je meer details kunt zien

Question 15

Resolutie betekenis

Answer 15

De minimale afstand waarbij je 2 punten van gelijke intensiteit van elkaar kunt onderscheiden

Question 16

Maximale theta (θ), en waar staat het voor?

Answer 16

180, Het staat voor de hoek van de stralen kegel die wordt opgevangen door het objectief.

Question 17

Labda λ

Answer 17

De golflengte van het gebruikte licht
> Hogere golflengte = lagere energie (meer rood) = hogere resolutie = minder details

Question 18

n

Answer 18

De refractieve index van het medium (olie>water>lucht)
Olielens > hogere n > kleinere resolutie > meer details

Question 19

Hoe kun je het geheel van dikke samples beter bekijken (stapeling voorkomen)?

Answer 19

Thin sliced samples

Question 20

Hoe kun je de genactiviteit meten bij microscopie?

Answer 20

Staining van RNA producten

Question 21

Het grote voordeel van fluorescentie microscopie

Answer 21

Het wordt gedaan met een fluorescente marker die in het DNA kan worden geplaatst zoals GFP. Daardoor hoef je de cel niet dood te maken en kun je dus eiwitten etc markeren in levende cellen.

Question 22

Brainbow

Answer 22

Fluorescente marker die elk neuron een aparte kleur geeft.

Question 23

Hoe werkt fluorescentie?

Answer 23

Het fluorescente eiwit absorbeert een foton en gaat naar excited state, en dan emissie foton met lagere energie (grotere λ).
> blauw licht op GFP, absorptie en emissie van groen licht.

Question 24

Waarom werkt GFP niet als je het met rood licht beschijnt?

Answer 24

Rood licht heeft te weinig energie om GFP in de excited state te brengen

Question 25

Hoe noem je het proces van een lagere energie foton uitscheiden dan opvangen?

Answer 25

Roodverschuiving

Question 26

Waarom is de roodverschuiving belangrijk bij fluorescentie microscopie?

Answer 26

Dan zie je contrast tussen het uitgezonden licht en de het licht wat terug komt van de fusie-eiwitten (filteren alleen groen licht)

Question 27

Hoe wordt alleen groen licht gefilterd in de fluorescentie microscoop

Answer 27

De beam splitting mirror zorgt ervoor dat blauw licht op de sample komt en dat het blauwe teruggezonden licht wordt teruggekaatst terwijl het groene licht erdooheengaat naar de detector. Voor de detector zit ook nog een emissiefilter wat specifiek het groene licht doorlaat.

Question 28

Waarom moeten quantum dots een hydrofiele coating hebben?

Answer 28

Anders vergiftigen ze de cellen

Question 29

Waarom moet de fluorescente dye Quantum dots worden ingebracht in de cel via microinjectie?

Answer 29

Door de coat is zijn de fotostabiele dots groot en ze zijn hydrofiel.

Question 30

Voordeel Qdots

Answer 30

Ze blijven lang aanwezig: lange fluorescentie.

Question 31

Immunofluorescence

Answer 31

o Primaire antibody herkent immobiele antigen A (in levende cellen vallen antilichamen uit elkaar door redoxpotentiaal (de zwavelbruggen vallen uit elkaar) > nanobodies kunnen dit wel oplossen, maar meestal niet gebruikt)
o Secundaire antibody bindt marker specifiek aan de primaire antibodies en deze zijn verbonden aan markers (fluorescent).

Question 32

Wat zorg ervoor dat we met een elektronenmicroscoop accuraat iets van 20 nm zien en bij een lichtmicroscoop als 200 nm

Answer 32

Door het licht en de glazen lenzen worden kleine punten tot een blur gemaakt.

Question 33

In de xy richting is de resolutie limitatie voor lichtmicroscopie 200 nm, wat is dit voor de z dimensie?

Answer 33

1000 nm

Question 34

Hoe wordt een blur genoemd door de resolutie limitatie?

Answer 34

Een Point Spread Function (PSF)

Question 35

Deconvolved image

Answer 35

Het op de computer nabewerken van onscherpe plaatjes van de lichtmicroscoop om de blurring effects wat weg te halen

Question 36

Widefield fluorescence microscopy: probleem en oplossing

Answer 36

-Out-of-focus moleculen uit diepere lagen van het sample worden ook aangeslagen en bereiken de multi-point detector. > Door een extra lens na het emissiefilter worden deze lichtstralen geredirectioneerd naar vlak voor de detector waardoor ze blurry worden terwijl de in-focus plane via de lens op de multi-point detector landt.

Question 37

Confocale microscopie

Answer 37

Ook de out-of focus moleculen worden aangeslagen bij widespread en de confocal lost dit op: metalen plaat met een kleine opening vlak voor de detector: de in-focus plane worden door de pinhole gefocust en bereikt de detector terwijl het grootste deel van de out-of-focus op de metalen plaat wordt gericht door het objectief en daarmee onzichtbaar wordt
> meer contrast in z-dimensie
>dunnere pinhole > des te dunner de slice die je focust

Question 38

3D imaging met de confocal

Answer 38

Verschillende z-coördinaten focussen van een sample met de confocal microscoop en galvanometer mirror toevoegen voor het verdelen van X-scans en Y-scans. Vervolgens in de computer de coupes samenvoegen tot 3D reconstructie

Question 39

Nadeel confocal

Answer 39

Langzaam (de widefield is sneller maar minder scherp)

Question 40

Functie Annexin-A4 en hoe visualiseren?

Answer 40

Reparatie celmembraan: koppelen aan GFP in HeLa cellen en een lek nadoen met toevoegen van een stofje waardoor al het groen naar de membranen gaan: eerst PM en met een delay kernmembraan.
> Assembly tot trimeer die als plug het membraan dichthoudt

Question 41

FRET principe

Answer 41

Protein X (blauw licht emissie en excitatie met UV) en Protein Y (groen licht emissie en excitatie met blauw). Als X en Y zo dichtbij elkaar liggen (bij interactie: visualisatie!) dan gaat na UV excitatie het blauwe licht van X vooral gebruikt worden ter excitatie van Y en zie je alleen (vooral) groen licht.

Question 42

Ca2+ biosensor voor activiteit van de cel gebaseerd op FRET: CFP (cyan) en YFP (yellow) aan calmodulin.

Answer 42

Lage Ca2+: grote afstand CFP en YFP, lage energie transfer (FRET), hoge CFP en lage YFP.
Hoge Ca2+: binden aan calmodulin verbonden aan CFP en YFP > brengt de twee bij elkaar na conformatieverandering > Hoge FRET > lage CFP en hoge YFP

Question 43

Hoe kan je beweging visualiseren dmv photoactivation (PA) van donkere GFPs?

Answer 43

Je exciteert een molecuul met een GFP (niet actief) heel gericht met blauw licht en dan kun je de verspreiding van het groene signaal meten

Question 44

Testen van een verbinding tussen bepaalde organellen: FRAP: Fluorescence Recovery After Photobleaching.

Answer 44

GFPs kapot maken door een heel geconcentreerde photobleaching laser in blauw > later wordt door eiwitproductie de kapotte GFP-fusie-eiwitten vervangen voor nieuwe in het organel > terugkeren fluorescentie.

Question 45

Wat toont FRAP mooi aan voor verbinding?

Answer 45

De route die eiwitten afleggen van ER naar Golgi

Question 46

Als je alleen naar het membraan wilt kijken en niet naar het cytoplasma dan kun je TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) gebruiken: hoe werkt dit?

Answer 46

Maken van een grote critical angle in de olie immersie > geen fluorescentie (licht komt niet door de cover slip maar toch worden de moleculen die vlak op het PM liggen van de sample op de cover slip, geëxciteerd. > visualisatie PM-eiwitten

Question 47

Verschillen elektronenmicroscopie tov lichtmicroscopie

Answer 47

-Gefixeerd weefsel ipv levend
-Stukje gaas ipv cover slip
-Kleurstof gebruiken om elektronen af te buigen (zware metalen als kleurstof > contrast)
-Detector gevoelig voor elektronen

Question 48

Transmissie EM

Answer 48

Elektronen vallen door de sample heen

Question 49

Scanning EM

Answer 49

Onder een hoek naar het oppervlak kijken van een sample: kijken naar gereflecteerde elektronen op het sample (reflectie door de contrast dye) > 3D reconstructie

Question 50

De resolutie is het hoogste bij deze elektronenmicroscoop

Answer 50

Scanning EM (minder details)

Question 51

Superresolutie: Stimulated Emission by Depletion (STED)

Answer 51

De beste life cell superresolutie
> Bovenop jhet objectief een beam van rood licht met in het midden een intensiteit van 0. > door het rode licht worden de pas aangeslagen moleculen niet fluoresceren (terug gepest als het ware) > alleen moleculen in het centrum van de STED beam (op 0) kunnen fluoresceren en zichtbaar worden > kleinere effectieve spot > kleiner dan 200 nm zichtbaar (lagere resolutie)

Question 52

Superresolutie: Stochastic Localization techniques (PALM, STORM, GSDIM)

Answer 52

De intensiteit van de blur wordt geplot (bij confocal) en dan wordt het midden van de blur bepaald en die word gebruikt in de image.
> bepaalde fluorescentie eiwitten kun je uit en aan zetten door met een groene laser een GFP vijand aan te zetten en GFP uit. Vervolgens voorzichtig met blauw licht GFP activeren zodat er een paar GFP receptoren aanslaan, en dan weer uitzetten.
> Steeds slaan er random GFP receptoren aan tot je alle GFP receptoren hebt gevisualiseerd door bepalen midden v.d. blurs.