SP-HC 3: Alberts h9 (Microscopy) Flashcards
Onder welke grootte kan een lichtmicroscoop niet in detail kijken?
< 200 nm
Voordeel lichtmicroscoop tov elektronenmicroscoop
Met de lichtmicroscoop kan je levende cellen bekijken
Hoe noemen we lichtmicroscopie met wit licht volledige transmissie?
Brightfield
Met welke kleurstoffen worden delen van de cel gekleurd (toebrengen contrast)? Wat wordt door DAPI gekleurd?
Histologische kleurstoffen. DAPI kleurt DNA.
Nadeel van de oude kleurstoffen
Je moet het celmembraan openmaken voor toebrengen > cel gaat dood
Blauw licht heeft een …. energie dan rood licht
Hogere energie (lagere golflengte)
Waarom kun je een blauwe kleurstof niet aan neuronen toevoegen?
Te hoge energie
De oude kleurstoffen doen wel/niet aan lichtemissie
Niet, ze absorberen alleen licht als het erop wordt geschenen
Enhancing contrast en dimregio
Het amplificeren van de golven als ze in fase zijn.
De dimregio is de plek waar twee golven elkaar uitdoven.
Differential interference
Absorberen en doorlaten van lichtgolven van een bepaald contrast
Dark field microscopy
Alleen lichtgolven (schuin onder geschoten), die onder een hoek binnenkomen en de cel raakt wordt afgebogen naar de detector, en bij de dikke delen van de cel gebeurt dat meer.
Dunne delen vd cel: zwart en de dikke delen grijs
Phase contrast (DIC microscopy)
Veel vertraging van de lichtbundels bij de dikke delen waardoor de golven uit fase raken en een dimregio vormen > hele dichte/condense organellen worden donker afgebeeld.
Formule voor resolutie
Resolution = (0.61 * λ) / (n * sin(θ))
Een kleinere resolutie betekent: meer of minder detail
Dat je meer details kunt zien
Resolutie betekenis
De minimale afstand waarbij je 2 punten van gelijke intensiteit van elkaar kunt onderscheiden
Maximale theta (θ), en waar staat het voor?
180, Het staat voor de hoek van de stralen kegel die wordt opgevangen door het objectief.
Labda λ
De golflengte van het gebruikte licht
> Hogere golflengte = lagere energie (meer rood) = hogere resolutie = minder details
n
De refractieve index van het medium (olie>water>lucht)
Olielens > hogere n > kleinere resolutie > meer details
Hoe kun je het geheel van dikke samples beter bekijken (stapeling voorkomen)?
Thin sliced samples
Hoe kun je de genactiviteit meten bij microscopie?
Staining van RNA producten
Het grote voordeel van fluorescentie microscopie
Het wordt gedaan met een fluorescente marker die in het DNA kan worden geplaatst zoals GFP. Daardoor hoef je de cel niet dood te maken en kun je dus eiwitten etc markeren in levende cellen.
Brainbow
Fluorescente marker die elk neuron een aparte kleur geeft.
Hoe werkt fluorescentie?
Het fluorescente eiwit absorbeert een foton en gaat naar excited state, en dan emissie foton met lagere energie (grotere λ).
> blauw licht op GFP, absorptie en emissie van groen licht.
Waarom werkt GFP niet als je het met rood licht beschijnt?
Rood licht heeft te weinig energie om GFP in de excited state te brengen
Hoe noem je het proces van een lagere energie foton uitscheiden dan opvangen?
Roodverschuiving
Waarom is de roodverschuiving belangrijk bij fluorescentie microscopie?
Dan zie je contrast tussen het uitgezonden licht en de het licht wat terug komt van de fusie-eiwitten (filteren alleen groen licht)
Hoe wordt alleen groen licht gefilterd in de fluorescentie microscoop
De beam splitting mirror zorgt ervoor dat blauw licht op de sample komt en dat het blauwe teruggezonden licht wordt teruggekaatst terwijl het groene licht erdooheengaat naar de detector. Voor de detector zit ook nog een emissiefilter wat specifiek het groene licht doorlaat.
Waarom moeten quantum dots een hydrofiele coating hebben?
Anders vergiftigen ze de cellen
Waarom moet de fluorescente dye Quantum dots worden ingebracht in de cel via microinjectie?
Door de coat is zijn de fotostabiele dots groot en ze zijn hydrofiel.
Voordeel Qdots
Ze blijven lang aanwezig: lange fluorescentie.
Immunofluorescence
o Primaire antibody herkent immobiele antigen A (in levende cellen vallen antilichamen uit elkaar door redoxpotentiaal (de zwavelbruggen vallen uit elkaar) > nanobodies kunnen dit wel oplossen, maar meestal niet gebruikt)
o Secundaire antibody bindt marker specifiek aan de primaire antibodies en deze zijn verbonden aan markers (fluorescent).
Wat zorg ervoor dat we met een elektronenmicroscoop accuraat iets van 20 nm zien en bij een lichtmicroscoop als 200 nm
Door het licht en de glazen lenzen worden kleine punten tot een blur gemaakt.
In de xy richting is de resolutie limitatie voor lichtmicroscopie 200 nm, wat is dit voor de z dimensie?
1000 nm
Hoe wordt een blur genoemd door de resolutie limitatie?
Een Point Spread Function (PSF)
Deconvolved image
Het op de computer nabewerken van onscherpe plaatjes van de lichtmicroscoop om de blurring effects wat weg te halen
Widefield fluorescence microscopy: probleem en oplossing
-Out-of-focus moleculen uit diepere lagen van het sample worden ook aangeslagen en bereiken de multi-point detector. > Door een extra lens na het emissiefilter worden deze lichtstralen geredirectioneerd naar vlak voor de detector waardoor ze blurry worden terwijl de in-focus plane via de lens op de multi-point detector landt.
Confocale microscopie
Ook de out-of focus moleculen worden aangeslagen bij widespread en de confocal lost dit op: metalen plaat met een kleine opening vlak voor de detector: de in-focus plane worden door de pinhole gefocust en bereikt de detector terwijl het grootste deel van de out-of-focus op de metalen plaat wordt gericht door het objectief en daarmee onzichtbaar wordt
> meer contrast in z-dimensie
>dunnere pinhole > des te dunner de slice die je focust
3D imaging met de confocal
Verschillende z-coördinaten focussen van een sample met de confocal microscoop en galvanometer mirror toevoegen voor het verdelen van X-scans en Y-scans. Vervolgens in de computer de coupes samenvoegen tot 3D reconstructie
Nadeel confocal
Langzaam (de widefield is sneller maar minder scherp)
Functie Annexin-A4 en hoe visualiseren?
Reparatie celmembraan: koppelen aan GFP in HeLa cellen en een lek nadoen met toevoegen van een stofje waardoor al het groen naar de membranen gaan: eerst PM en met een delay kernmembraan.
> Assembly tot trimeer die als plug het membraan dichthoudt
FRET principe
Protein X (blauw licht emissie en excitatie met UV) en Protein Y (groen licht emissie en excitatie met blauw). Als X en Y zo dichtbij elkaar liggen (bij interactie: visualisatie!) dan gaat na UV excitatie het blauwe licht van X vooral gebruikt worden ter excitatie van Y en zie je alleen (vooral) groen licht.
Ca2+ biosensor voor activiteit van de cel gebaseerd op FRET: CFP (cyan) en YFP (yellow) aan calmodulin.
Lage Ca2+: grote afstand CFP en YFP, lage energie transfer (FRET), hoge CFP en lage YFP.
Hoge Ca2+: binden aan calmodulin verbonden aan CFP en YFP > brengt de twee bij elkaar na conformatieverandering > Hoge FRET > lage CFP en hoge YFP
Hoe kan je beweging visualiseren dmv photoactivation (PA) van donkere GFPs?
Je exciteert een molecuul met een GFP (niet actief) heel gericht met blauw licht en dan kun je de verspreiding van het groene signaal meten
Testen van een verbinding tussen bepaalde organellen: FRAP: Fluorescence Recovery After Photobleaching.
GFPs kapot maken door een heel geconcentreerde photobleaching laser in blauw > later wordt door eiwitproductie de kapotte GFP-fusie-eiwitten vervangen voor nieuwe in het organel > terugkeren fluorescentie.
Wat toont FRAP mooi aan voor verbinding?
De route die eiwitten afleggen van ER naar Golgi
Als je alleen naar het membraan wilt kijken en niet naar het cytoplasma dan kun je TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) gebruiken: hoe werkt dit?
Maken van een grote critical angle in de olie immersie > geen fluorescentie (licht komt niet door de cover slip maar toch worden de moleculen die vlak op het PM liggen van de sample op de cover slip, geëxciteerd. > visualisatie PM-eiwitten
Verschillen elektronenmicroscopie tov lichtmicroscopie
-Gefixeerd weefsel ipv levend
-Stukje gaas ipv cover slip
-Kleurstof gebruiken om elektronen af te buigen (zware metalen als kleurstof > contrast)
-Detector gevoelig voor elektronen
Transmissie EM
Elektronen vallen door de sample heen
Scanning EM
Onder een hoek naar het oppervlak kijken van een sample: kijken naar gereflecteerde elektronen op het sample (reflectie door de contrast dye) > 3D reconstructie
De resolutie is het hoogste bij deze elektronenmicroscoop
Scanning EM (minder details)
Superresolutie: Stimulated Emission by Depletion (STED)
De beste life cell superresolutie
> Bovenop jhet objectief een beam van rood licht met in het midden een intensiteit van 0. > door het rode licht worden de pas aangeslagen moleculen niet fluoresceren (terug gepest als het ware) > alleen moleculen in het centrum van de STED beam (op 0) kunnen fluoresceren en zichtbaar worden > kleinere effectieve spot > kleiner dan 200 nm zichtbaar (lagere resolutie)
Superresolutie: Stochastic Localization techniques (PALM, STORM, GSDIM)
De intensiteit van de blur wordt geplot (bij confocal) en dan wordt het midden van de blur bepaald en die word gebruikt in de image.
> bepaalde fluorescentie eiwitten kun je uit en aan zetten door met een groene laser een GFP vijand aan te zetten en GFP uit. Vervolgens voorzichtig met blauw licht GFP activeren zodat er een paar GFP receptoren aanslaan, en dan weer uitzetten.
> Steeds slaan er random GFP receptoren aan tot je alle GFP receptoren hebt gevisualiseerd door bepalen midden v.d. blurs.
