SP-HC 2: Alberts h16 (Cytoskeleton) Flashcards
Noem enkele toepassingen van actinefilamenten
Microvilli, contractile ring (cytokinese)
Enkele functies van microtubules
Structuur voor motoreiwitten: transport eiwitten en organellen, centrosoom: interphase microtubule array: mitotic spindle
Enkele functies intermediate filaments
Stevigheid in het cytoplasma, nuclear lamina
Wat wordt bedoeld met dynamisch evenwicht van het cytoskelet?
Snelle reactie op signalen en snelle diffusie door de regulatie van de polymeren > hergebruik van de monomeren
Adherens junctions
Plek tussen epitheliale cellen waar cilinderbanden van actinefilamenten de verbindende eiwitten (oa cadherins) vasthouden > daarmee worden de cellen verbonden
Desmosomen
Aan de desmosomen tussen de epitheliale cellen zitten de intermediaire filamenten verbonden (laterale zijde)
Hemidesmosomen
Aan basolaterale zijde: daar zitten intermediatefilamenten vast (gekoppeld) aan de basal lamina (basement membrane)
Hoe zijn intermediate filaments opgebouwd?
Als coiled-coil dimeren die zelfde N- en C-termini hebben.
>Vorming staggared tetrameer uit twee coiled-coil-dimers antiparallel. > puntsymmetrie: geen voor- en achterkant.
> Kabel uit 8 tetrameren
Kenmerken intermediate filaments qua stevigheid
De intermediate filaments geven stevigheid en mechanische stabiliteit aan de cel en zijn flexibel, maar lastig uitrekbaar. (zoals een touw)
Soorten intermediate filaments
-Nuclear: lamines > nuclear lamina
-Vimentin-like: Vimentin (mesenchymal), desmin (muscle), Glial fibrillary acidic protein, peripherin (some neurons)
-Epithelial: Type I (acidic) or Type II (neutral or basic) keratins
-Axonaal: neurofilament proteins
Waarom is er hoge concentratie Ca2+ in de perinuclear space?
De lumen van de kern envelop is continue met het ER.
Hoe is de nuclear lamina verbonden mt het cytoplasmatische cytoskelet?
Transmembraaneiwitten verbinden nuclear lamina (SUN-domain) met cytoplasmatisch cytoskelet (KASH domain)
Wat gebeurt er met de nuclear lamina bij kerndeling?
Fosforylatie van de lamines en NPC-eiwitten
> Nuclear lamina, en dus nucleus, valt uit elkaar
> chromosomen komen in cytoplasma
> In de telofase van de M-fase vormt de kernenvelop opnieuw met nuclear lamina.
Epidermolysis bullosa simplex
Skin blisters in response to slight mechanical stress > genetic defect keratin
Amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
Neurodegeneratieve ziekte door abnormale assembly (genetisch defect) van neurofilamenten in de axonen
> spieratrofie en dodelijk
Waaruit bestaan de microtubule protofilamenten? En wat is de polariteit?
Uit dimeren van α-tubulin en β-tubulin.
> Groei aan de plus-end door additie van de dimeren
> β-tubulin heeft GTP gebonden aan plus-end, maar intrinsieke GTPase activiteit: na verloop van tijd GTP naar GDP.
> 13 protofilamenten vormen een microtubule in een wentelpatroon
Waar is de minus-end van een microtubule vaak aan verbonden?
Een microtubule organizing centre (MTOC) zoals het centrosoom in dierlijke cellen
Dynamische instabiliteit van microtubules
Er moet een GTP-cap aan het plus-end zitten, en als er te weinig tubulinedimeren zijn voor polymerisatie, dan verliest de microtubule de GTP-cap en dan catastrophe
> Snelle krimp van microtubules door de hoek van de GDP conformatie > buiging en te grote spanning en snel uit elkaar vallen. Verliezen contact met andere protofilamenten en instabiel.
> Rescue van de GTP-cap als er weer tubulinedimeren binden
Hoe wordt de minus-end van microtubules gestabiliseerd?
Door een γ-tubulin ring (nucleation site) > bij dierlijke cellen zijn de γ-tubulin rings gelokaliseerd op het centrosoom (werking als MTOC).
Wat vormt de γ-tubulin ring met andere eiwitten als nucleation site?
Een TuSC-complex > minus-end met γ-tubulin ring, en vanaf de γ-tubulin binden er weer α/β -tubulin dimeren.
Wat is er te vinden in een centrosoom?
Een paar centriolen
De functie van dynamic instability
Exploreren van de cel door random groei en krimp: als een microtubule een stabiliserende structuur tegen komt dan zijn er capping eiwitten die de GTP-cap van de microtubules stabiliseert: stabiele microtubule.
(bv naar Golgi voor vesicle transport)
Wat is de structuur van het actieve chromophore in GFP?
Een cyclische tripeptide
Structuur van GFP
β-barrel met chromophore aan binnenkant
GFP is de FRET acceptor van …
Aequorin (Ca2+ geactiveerd)
Waar kan de GFP worden geplakt in het fusie-eiwit als de N- én C-terminus belangrijk zijn voor de functie?
In een onbelangrijk loopje
Hoe kun je microtubules visualiseren met GFP?
GFP fusion protein van MAP (microtubule associated protein) > die binden aan zijkanten van microtubules.
EB3 functie
Een eiwit wat aan de GTP-cap bindt van de plus-end van groeiende microtubules
GTP-bindende eiwitten: wat doet FtsZ?
Bacterieel: hydrolyseert GTP: conformatieverandering: een ring ontstaat aan de binnenzijde van het PM en die lijkt nauwer te worden > celdeling
Dynamine
Het zoogdieren homoloog aan FtsZ: betrokken bij mitochondriale deling (endosymbiose theorie?)
> hydrolyseert GTP > conformatieverandering
MreB en Mbl
Actine homologen die de vorm van bacteriën behouden > vormen een spiraal naast het PM voor vormbehoud
> Hydrolyseren ATP
Waarom zijn motoreiwitten nodig voor de intracellulaire transport?
Omdat passieve diffusie te langzaam is voor vesicle en organellen transport
Kinesines: welke kant bewegen ze op?
Naar plus-end van de microtubules
Structuur kinesines
Coiled-coils met twee motor ATPase domeinen.
Noem verschillende kinesines
Kinesin-1
Kinesin-5
Kinesin-13
Kinesin-14
Beweging kinesines
Lagging head hydrolyseert ATP tot ADP + Pi en beweegt een stap naar voren en de nieuwe lagging head bindt Pi en krijgt ATP gebonden.
Dyneines bewegen naar het ….
Minus-end
Hoe zijn dyneines verbonden met een vesicle?
Via Dynactin (met oa een Arp1 filament: actine minifilament) en een adaptor protein.
De ATP binding heads binden op een stereospecifieke manier: wat houdt dit in (dyneines)?
Alleen aanhechting op bepaalde oriëntaties van de microtubule.
Brownian motion
Schokkerige beweging
Pigment en motoreiwitten bij zeedieren met schutkleur
Pigment op de motoreiwitten gereguleerd door cAMP.
> Hogere cAMP: pigment naar plus-ends > donker (via kinesines)
> Lage cAMP: pigment naar minus ends: licht (via dyneines)
Kinesines kunnen in axonen vesicles met neurotransmitters naar een axon terminal brengen. Maar hoe komen de kinesines weer terug bij het cellichaam? (minus-end)
Sommige dyneines kunnen kinesines meenemen naar het minus-end > piggyback mechanism
Evenwichten van groei microtubules
Evenwicht voor polymerisatie bij plus-end
Evenwicht voor depolymerisatie bij minus-end
+TIP binding proteins (zoals EB3)
Binden aan plus-end van microtubules en kunnen ze aan structuren verbinden en stabiliseren.
Augmin
Nucleates microtubule branching
MAP2
Stabiliseert filament bundeling via cross-linking van microtubules
Tau
Microtubule crosslinker met een kortere staart dan MAP2 > condense microtubule bundeling > betrokken bij bv Alzheimer
MAPs
Stabiliseren microtubules door aan de zijkanten te binden
Kinesine-13
Een motoreiwit maar ook een catastrofe-inducer: een motoreiwit die een curvature conformatie aan de protofilamenten geeft
XMAP215
Stabiliseert het plus-end en promoot snelle microtubule groei > primen van tubulinedimeren
Verschil dynamische en stabiele microtubules
Dynamisch: > meer dynamische microtubules: meer catastrofes én groei
Stabiel > minder catastrofes en meer rescues
Stathmin
Bindt α/β tubulin dimeren en preventie van vorming van microtubules
> ook minder dimeren beschikbaar voor de rescue van microtubules en induceren catastrofe
Katanine
Kan gaten maken in microtubules waardor ze uiteindelijk doormidden breken
Wat gebeurt er na breken van microtubules
-Snelle regrowth
-Catastrofe als er geen aanzet tot nieuwe groei is
Waaruit bestaan centriolen?
Speciaal gefuseerde microtubule tripletten die bij elkaar worden gehouden door SAS-6
> Centriolen delen vóór de celdeling
Waaruit bestaan mobiele cilia en flagella?
Microtubules en dyneines
> Microtubule doublet met gekoppelde dyneines die naar minus-end bewegen waardoor plus-end gaat verschuiven.
> Spiraalachtige beweging door het bij elkaar houden van de microtubules ondanks de dyneine-beweging (door nexines): buiging bij plus-end
Beweging van een dyneine
Uitgooien van een bindend armpje op een andere microtubule en dan een powerstroke waardoor de dyneine 8 nm richting de minus-end van de microtubule waar het op zit beweegt.
Actinemonomeer heeft … gebonden en wanneer het in een polymeer zit dan … gebonden
ATP; ADP
Hoe worden actinefilamenten ook wel genoemd?
De microfilamenten
Polaire constructie van de actinefilamenten
Een plus-end en minus-end (polariteit, maar in totaal ongeladen)
Zijn actinefilamenten stabiel?
Nee ze kunnen constant aan beide uiteinden groeien en krimpen, maar de lengte blijft in een steady state
Fasen van ontstaan van actinefilamenten
-Nucleatie, elongatie, steady-state
> nucleatie is een tijdsbeperkende stap: hoe hoger de concentratie actine, hoe groter de kans op nucleatie. > vroeg gevormde oligomeer vormt een ‘nucleus’ voor verdere elongatie
Functie dynamische instabiliteit bij microtubules
Exploreren van de cel, zoeken naar capping proteins voor stabiliserende strucuturen
Treadmilling bij actinefilamenten
-In lengte blijft het filament een steady-state: even veel depolymerisatie (minus-end) als polymerisatie (aan plus-end)
Kritische concentratie bij actinefilamenten
De concentratie actine die ervoor zorgt dat er procies geen polymerisatie en depolymerisatie is aan een uiteinde. De Cc(D) (minus end) is hoger dan de Cc(T)
- Cc(D) > Cc(T)
Wanneer treedt er treadmilling op (kritische concentraties)?
Cc(T) < C < Cc (D)
- depolymerisatie aan minus-end
- polymerisatie aan plus-end
Wanneer is er aan beide kanten groei of krimp?
Beide kanten groei: C > Cc(D) > Cc(T)
Beide kanten krimp: C < Cc(T) < Cc(D)
Chemical inhibitors van actinefilamenten: Latrunculin, Cytochalasin B, Phalloidin.
-Latrunculin (bindt actine subunits) > depolymerisatie
-Cytochalasin B (caps filament plus-end) > depolymerisatie
- Phalloidin: stabilisatie (bindt langs de filamenten)
Chemical inhibitors van microtubules: taxol, nocodazole, colchicine (noem de functies)
-Taxol: bindt langs de filamenten waardoor de kritische concentraties geen nut meer hebben > stabilisatie (zwaar giftig en tevens gebruikt als cytostatica > cellen delen niet meer)
-Nocodazole: bindt tubuline subunits: depolymerisatie
-Colchinine: caps filament ends: depolymerisatie
Hoe zijn de ER tubes verbonden?
Met kinesines > rekken van het netwerk
Hoe is het Golgisysteem verbonden?
Aan dyneines > co-lokalisatie met de MTOC
Wat gebeurt er met de ER en de Golgi-apparaat als er geen microtubules zijn?
Ze vallen uit elkaar en worden gedelokaliseerde vesicles > is continu met nuclear envelope en dus liggen chromosomen dan los in de cel > verlies van de eukaryote cel.
Lokalisatie eiwitten en motoreiwiiten
Dyneines brengen vesicles van ER naar Golgi en kinesines van trans-Golgi naar PM
Tropomyosine (actine binding protein)
Stabiliseert actinefilament
Profiline
Stimuleert polymerisatie > bindt aan actinemonomeer tot een complex
Thymosine
Bindt actine subunits en preventie van polymerisatie
Nucleatie en branching van actinefilamenten
De nucleating-promoting factor vormt met Arp2/3 een actief Arp2/3-complex die samen met actinemonomeren een groeiende actinefilament vormt (de Arp2/3 kant is de minus-end).
Onder welke hoek komt branching voor bij actinefilamenten?
70 graden
Formine
Kan ervoor zorgen dat er nieuwe monomeren worden ingebouwd (polymerisatie)
> zit vast aan PM
> blijft geassocieerd met het filament
> Primes profilin bound to actin
Hoe kunnen bacteriën het actine cytoskelet gebruiken?
Ze hebben ActA op het membraan, en als ze in de host cell zitten, dan kunnen ze met ActA de host-Arp2/3-complexen activeren > maken van branches en de groeiende actinefilamenten duwen de bacterie vooruit > bewegen in milieu
Hoe kan de kritische concentratie stijgen?
Als met capping eiwitten een (plus-) uiteinde van een filament wordt geblokkeerd
> hogere concentratie actine nodig voor polymerisatie (want dat kan alleen nog maar aan minus-end), en depolymerisatie komt eerder voor (op minus-end).
Cofiline
Vormt en spiraal om het filament en zorgt ervoor dat er een condense structuur ontstaat en dat het actinefilament uiteindelijk doormidden breekt
High-order actinefilament arrays: structuur
- Stress fibers: antiparallel actinefilamenten (contractile bundle)
- Cell cortex: branched & unbranched network.
- Lamellipodium: brached network van actine (pootjes)
- Filopodium: tight parallel network
Fimbrine
Monomeer dat 2 actinefilamenten naast elkaar bindt
> parallel bundle
Alpha-actinine
Een dimeer met 2 bindingsplaatsen voor actinefilamenten antiparallel
Antiparallel en grotere afstand dan fimbrine> contractile bundle/stress fibers
Filamine
Dimeer tweepoot met 2 bindingsplaatsen voor actinefilamenten
> branched network
Spectrine
Tetrameer met grote afstand tussen twee bindingsplaatsen > antiparallel
Soorten celmigratie
- Mesenchymaal: via lamellipodia via actine cytoskelet.
- Amoebe: maakt pseudopods van actine cytoskelet
- Blubbing: geen stevigheid in het bolvormig uitsteeksel (fosfolipiden maar geen actine), maken van een bleb: is niet goed, voorteken van celdood
Waar zijn Arp2/3 complexen vooral gelokaliseerd in de cel? en hoe zit het met actine? en cofiline?
Arp2/3 in de periferie evenals actine, als een ring daarbinnen zit cofiline wat de filamenten kapot maakt voor vrijkomen van monomeren > voor beweging achterste deel
Hoe wordt de kracht van polymerisatie (beweging/groei) behaald?
ATP hydrolyse
Protusion > vooruit bewegen van de cel
Myosinecontractie van een myosinefilament tussen actinefilamenten, de cel vindt via integrines in het PM vast aan het ECM en daardoor kan de cel bewegen
> myosinecontractie
> retrogade flow (myosine loopt vooruit op het filament maar deze zit vast > beweging filament)
> door houvast aan ECM vooruit bewegen (groei actinefilament)
(disengaged > engaged)
Rho small G proteins en actine arrays
-Cdc42: filopodia
-Rho: stress fibers
-Rac: lamellipodia
Rac pathway
Rac-GTP actief
> Activatie WAVE (Nucleation promoting factor NPF) en PAK
> WAVE rekruteert Arp2/3 (branching nucleator) en profiline met gebonden actine kan binden > brached actin network
> PAK inhibeert MLCK en MHC (die leiden tot minder myosine activiteit > minder contractiliteit en stress fibers)
Rho pathway
Rho-GTP
> activatie formines en ROCK (Rho dependent kinase)
> formines zorgen voor unbrached actinebundel (meer stress fibers en contractiliteit, en meer focal adhesion formation)
> ROCK fosforyleert en activeert MLC en inhibeert MLC phosphatase en promoot LIM kinase
> LIM kinase inhibeert cofiline (cofiline = afbraak actine)
> MLC(P) leidt tot meer contractiliteit, stress fibers etc
Polariteit van de cel wordt gereguleerd door welke familie eiwitten?
Rho protein family members
Cdc42 pathway en budding
Cdc42 en PAK/GEF cluster
> maken actinefilamenten vanuit actief formine
> myosine V activiteit over actinefilamenten voor yeasy vesicle budding
Celmigratie en Rho GTPases
-Achterkant: aan voorkant bindt chemoattractant aan GPCR met G12/13 > Rho actief in achterkant > stress fibers (actine myosine contractie) > remming Rac activiteit door remmen PIP3
-Voorkant: GPCR aan voorkant vindt chemoattractant > Gi > activatie PIP3 > Rac domineert > polymerisatie (protusion) en remmen Rho activiteit. > lamellipodia
Wat moeten de GPCRs waarnemen voor celmigratie?
Een gradiënt: signaleringscascade moet geadapteerd zijn.
PIP3 en celmigratie
PIP3 is een belangrijk migratiesignaal
> daar waar het PIP3 signaal blijft, protusion
> fosfatases hebben standaard activiteit voor PIP3, alleen als PI3-K lokaal hoog geconcentreerd (bij hoge concentratie chemoattractant) is dan blijft PIP3 actief.
Kenmerken myosine motoreiwitten
Op actinefilamenten
> lopen naar plus-end
> coiled-coil met bindende motor myosine heads (als 1 motor domein)
> verbruikt ATP
> power strokes > 1 monomeer verschuiven
> bindt aan actine met ADP gebonden, dan laat ADP los: power stroke, dan bindt ATP en laat de head los, ATP hydrolyse zorgt voor reset van head naar beginpositie.
Wat moet je in vitro toevoegen aan vastzittend myosine voor beweging van actinefilamenten? en welke kant bewegen ze op?
ATP, en aangezien myosine naar de plus-end loopt bewegen de filamenten dan richting minus-end
MLCK functie
Fosforylatie van light chains van myosine motors > bipolar myosinefilament vormt (voor spiercontractie)
Types Myosine motors
-Myosine-II
-Myosine-V: grotere lever arm: grotere stappen, overslaan van een aantal monomeren per power stroke.
Sarcomeer: wat is CapZ, titin, nebulin, tropomodulin?
-CapZ; verbindt actine (thin) filament plus-end aan de Z-disc
-Titin: verbindt myosinefilamenten aan Z-disc: houdt de myosine-II-filamenten precies tussen 2 actinefilamenten in
-Nebulin: zit als een spiraal om actinefilamenten, werkt als een liniaal en houdt de lengte goed
-Tropomodulin: cap voor de minus-end van actinefilamenten
Sarcomeer contractie
Als myosine heads de power stroke doen en naar het plus-end bewegen (actinefilamenten bewegen richting minus-ends) > Z-discs gaan naar elkaar toe bewegen
Waar in de spiercel liggen myofibrillen?
in het cytoplasma
Aanzetting tot spiercontractie: vrijmaken Ca2+
Plasmamembraan (T-tubule membraan) depolariseert in de spiercel (T-tubule lumen = extracellulair)
> calcium vanuit T-tubule door een voltage gated Ca2+ channel naar cytoplasma
> door beetje calcium de cel in gaan Ca2+ dependent Ca2+ release channels van Sarcoplasmatisch reticulum (SR) open.
> Ca2+ komt vrij voor contractie
Ca2+ en spiercontractie
Ca2+ bindt aan troponine complexen die verspreid op actinefilamenten van sarcomeer liggen
> tropomyosine wat over het actinefilament ligt verschuift
> binding sites voor myosine komen vrij in de myofibril
Twee processen van spiercontractie kosten ATP. Welke?
-Reset van de myosine heads conformatie (na een power stroke en release)
-Terugpompen van al het Ca2+ kost ATP
