Sangersekvensering

Question 1

hva er molekylær patologi?

Answer 1

Den delen av patologien som studerer og diagnostiserer endringer i celler og vev på molekylært nivå

Påviser evt. forandringer i DNA, RNA eller proteiner

Resultatene brukes i diagnostikk eller for å bestemme om pasienter kan ha nytte av en
bestemt type behandling

Question 2

forklar disse begrepene: persontilpasset kreftbehandling, målrettede legemidler og immunterapi

Answer 2

Persontilpasset kreftbehandling
Pasientene får skreddersydd behandling
ut fra tumorens genetiske profil
Går fra å behandle på gruppenivå til å
behandle på individnivå
One size does not fit all

Målrettede legemidler
Medikamenter som rettes direkte mot
spesifikke gener eller proteiner som er
viktige for kreftcellenes vekst, eks:
HER2+ brystkreft
Trastuzumab (monoklonalt Ab) hemmer signaler fra human epidermal vekstfaktor reseptor
Lungekreft
Gefitinib hemmer signaler fra aktiverende mutasjoner i epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR)

Immunterapi
Kreftbehandling som stimulere kroppens eget
immunforsvar til å angripe kreftcellene

Question 3

forklar trinnene i dna og rna isolering

Answer 3

1.Vev fra blokk overføres til rør

2.Deparafinisering, dehydrering og tørking
Tilsetter xylen og etanol

3.Lysering
Tilsetter lyseringsbuffer og proteinase K
Varmebehandler

4.Kolonnebasert isolering
Nukleinsyrene binder til membranen i
kolonnen
Vasketrinn med etanolholdig buffer
Eluering

5.DNA/RNA-kvantitering og kvalitetskontroll

Question 4

forklar sanger sekvensering

Answer 4

vanligvis vil baser inneholde en ende med alkohol,
men om denne alkoholen er borte vil det føre til
at dna polymerase stopper opp og det ikke vil bli
tilsatt noe mer på dna tråden, denne heter for ddnt.
pcr produkt sammen med primer, dntp (baser) og dna polymerase
blir tisatt i 4 rør. det blir også tilsatt farget ddnt men i lave konsentrasjoner.
dvs at i rør 1 er det ddatp, i 2 er det ddttp, 3=ddgtp og 4 =ddctp
så i rør 1 vil etter primeren, nukleotidene settes på som normalt vha polymerase
men om det kobles til ddatp vil reaksjonen stoppe pga det ikke er noen
alkohol gruppe på den. dette skjer helt tilfeldig og man vil ende opp
med flere tråder som har endt på forskjellige tidspunkt.
hvis lengden på fraksjonen er kjent kan man finne ut av hvor i tråden
nukleotid A er. lengden kan man finne på eks gel elektroforese.
hvis man ser dette på alle rørene som også har farget ddnt men for andre baser (t, g eller c)
kan man sette alle på gel elektroforese og siden alle vil ha forskjellig
størrelse og dermed forskjellig plassering på gelet kan man finne
ut av hvilke base som er først siden den vil komme seg kortest på gelet. man setter deretter inn en laser slik at fargene til de forskjellige fluorokrommene kan ses og vi kan lese av base sekvensen
i next gen sekvensering vil hver av ddnt ha en fluoriscerende forbindelse
festet på seg som hver gi forskjellige farger. det kan dermed bli mulig å
gjøre alle reaksjonen i 1 tube istedenfor 4. istedenfor geleeletroforese vil
det her bli brukt kapilærelektroforese som er mer nøyaktig. blir deretter
brukt en maskin som skyter inn laser og detekterer de forskjellige
fluoricerende fargene for deretter å kunne si noe om baserekkefølgen til genet.

Question 5

hva er viktig i prosesseringen av rådata for sangersekvensering?

Answer 5

Multicomponent analysis
Separerer signalet fra de fire fluorescerende komponentene inn i distinkte spektrale komponenter for å unngå interferens pga. spektralt overlapp

mobility shift correction
korrigere endringer i elektroforetisk mobilitet i sekvenseringsproduktet forårsaket av de ulike fluorokromene

basecalling
tilpasser det fluorescerende signalet slik at hver base tildeles en topp i elektroferogrammet

Question 6

hva er punktmutasjon, insersjon og delesjon?

Answer 6

Punktmutasjon (SNV)
Endring i DNA-sekvensen forårsaket av
at én nukleotid byttes ut med en annen

Insersjon: innsetting av ett eller flere basepar i DNA-sekvensen

Delesjon: tap av ett eller flere basepar i DNA-sekvensen